부르키나브 학생의 레티놀 동위원소 희석 기술의 검증 및 단순화 (RID_VAB)

프로젝트 제목 부르키나베 학생의 레티놀 동위원소 희석 기술 검증 및 단순화

I. 최적의 표준을 반영하는 비타민 A 상태의 배경 및 합리적인 바이오마커(예: 간 생검)가 이용 가능하지만 인구 기반 응용 분야에서 접근성을 높이기 위해 개선되고 있습니다. 레티놀 동위원소 희석(RID) 테스트는 그러한 바이오마커 중 하나입니다. 부르키나파소에서는 예측 방정식에 수정 인자를 간단히 추가하여 14차원 테스트로 7차원 테스트를 평가할 수 있었습니다. 전체 신체 비타민 A 저장량의 값은 유사했지만 간 보유량이 증가함에 따라 변화가 증가했습니다. 학령기 아동의 간 중량을 체중의 3%로 가정하는 것이 총 간의 비타민 A 보유량 계산에서 적절한 것으로 확인되었습니다. 인구 평가를 위한 동위원소 희석 단순화와 질량 분석 분석을 위한 역량 구축은 공중 보건 프로그램에 정보를 제공하는 영양 개발의 중요한 영역입니다. 이 제안은 널리 사용되도록 방법을 지속적으로 개선할 것입니다.

II. 전반적인 목표 비타민 A 상태를 결핍에서 과잉까지 평가하기 위해 대규모 인구 조사에서 레티놀 동위원소 희석 기술을 사용하는 방법에 대한 새로운 지식을 제공합니다.

II.1. 구체적인 목표 이 CRP에는 몇 가지 구체적인 목표가 설명되어 있습니다. 부르키나파소에서 수행될 연구와 기존 데이터 세트를 통해 우리는 학생들의 다음과 같은 구체적인 목표에 중점을 둘 것입니다.

1. RID 테스트를 받은 학생의 공복 혈청 레티닐 에스테르 데이터를 적용하여 비타민 A 초과 총 간 예비 값을 정의합니다. 2. 현장 레티놀 정제 기술을 사용하여 정확도 손실 없이 모집단 조사에 맞게 기존 방법론을 단순화할 수 있는 방법을 검토합니다. 3. 아프리카 미취학 아동을 대상으로 기존 데이터 세트를 이용하여 레티놀 동위원소 희석법이 투여 시 염증에 어떤 영향을 미치는지 알아보고자 한다. 오일에서 추출한 3,4-디데히드로레티닐 아세테이트와 학령기 아동의 캡슐화된 형태.

III. 방법 III.1. 연구 장소 및 인구 제안된 연구는 부르키나 파소 서부, 보보 디울라소(Bobo Dioulasso) 외곽 가장자리 마을인 오로다라(Orodara)에 있는 초등학교에서 수행될 예정이며, 그곳에서 7세에서 12세 사이의 어린이를 대상으로 할 것입니다. 마을 주민 대부분은 중산층 농민과 그 가족이다. 부르키나파소는 기존 개입 및 정책에 알리기 위해 VA 상태를 정확하게 결정하는 데 관심이 있는 컨소시엄 VITAAFRO(아프리카의 비타민 A)에 참여하는 국가 중 하나입니다.

III.2. 연구 설계 한 학년 동안 두 번의 연속적인 단면 연구가 수행됩니다. 장마철이 끝나고 망고 시즌이 끝난 학년 초에 첫 번째 연구와 첫 번째 데이터 수집 후 5~6개월 후 두 번째 연구는 망고 시즌 동안 이러한 연구는 보보 디울라소(Bobo Dioulasso) 외곽 마을인 오로다라(Orodara)에 있는 부르키나 파소 서부의 초등학교에서 수행될 것입니다.

III.3. 샘플링 방법 두 가지 방법으로 총 158명의 학생을 모집합니다. 처음에는 초등학교 1학년부터 마지막 ​​학년까지의 어린이를 포함하고 학급당 인원수에 비례하여 계층화된 샘플링을 통해 60명의 학교 어린이 그룹을 모집합니다. 60명의 학교 어린이로 구성된 첫 번째 그룹에는 총 신체 저장량 평가를 위한 레티놀 동위원소 희석(RID) 테스트를 적용하여 기준선에서 공복 혈청 레티닐 에스테르 농도와 값을 비교합니다.

나머지 98명의 학교 아동은 계층화된 샘플링과 학급당 인원수에 비례하여 모집되며 성별에 따라 49명의 아동으로 구성된 두 그룹으로 나뉩니다. 여성 49명, 남성 49명). 각 참가자마다 혈액 샘플링의 두 시점이 수행됩니다. 참가자는 아래 지정된 대로 H0, H2, H3, H4, H5 H6 H8, H10, H24, H72, H168 및 H336에서 혈액 샘플링을 받도록 무작위로 배정됩니다. 무작위 목록은 난수 테이블을 사용하여 생성됩니다. 우리는 단순한 무작위 배정보다는 차단을 선택했습니다. 왜냐하면 전자의 접근 방식을 사용하면 시험 전체에 걸쳐 대략 동일한 크기의 편견 없는 비교 그룹을 가질 수 있기 때문입니다. 블록 무작위화를 사용하면 각 연구 그룹에는 항상 거의 동일한 수의 어린이가 있게 됩니다.

이러한 어린이 그룹에 대해 비타민 A 상태의 질적 측정인 변형 상대 용량 반응(MRDR) 테스트를 사용하여 3,4-디데히드로레티닐 아세테이트의 흡수를 조사할 것입니다.

H0(5), H2(5), H3(5), H4(11), H5(11) H6(11) H8(10), H10(10) , H24(5), H72(5), H168( 10), H336 (10)

III.4. 지역사회 인식 및 민감화 연구를 시작하기 전에 연구를 위해 지역사회의 인식을 제고하고 동원하기 위한 노력의 일환으로 연구 분야의 주요 의사 결정자 및 지역사회 지도자들과 일련의 회의를 실시할 것입니다. 이러한 지역사회 지원 및 민감화 회의는 연구의 존재와 목적뿐만 아니라 해당 지역사회뿐만 아니라 국가와 아프리카 전체에 미치는 이점에 대해 지역사회에 알릴 것입니다. 각 인간 연구의 영역을 선택하는 이유와 제안된 설계에 대해 설명합니다.

III.5. 모집 및 심사

심사 과정으로 적격 학생 목록이 작성되어 선택이 수행됩니다. 어린이는 다음 심사 기준을 충족하는 경우 참여할 수 있습니다.

III.5.1. 포함 기준:

• 7~12세의 초등학생
• 아동의 보호자 또는 부모가 사전 동의를 기꺼이 제공할 것입니다.
• 자녀의 가족은 연구 기간 동안 연구 지역에 계속 거주할 계획입니다.

III.5.2. 제외 기준:

• 비타민 A 결핍의 임상적 증거 잘못된 형식 : Anglais (Royaume-Uni) 잘못된 형식 : Anglais (États-Unis) 잘못된 형식 : Anglais (États-Unis) 잘못된 형식 : Anglais (États-Unis)
• 심각한 영양실조(연령별 체중 Z 점수(WAZ) 또는 연령별 신장 Z 점수(HAZ) <-3 SD)
• 결핵, 증상이 있는 HIV 감염을 포함한 심각한 질병
• 6세 미만 또는 12세 초과 어린이 III.6. 연구 변수 자격 심사 후 아동과 보호자 또는 부모로부터 사전 동의를 얻습니다. 우리는 사회 경제적 정보(예: 소득, 교육, 가족 자산)을 수행하고 인체 측정(체중, 키), 헤모글로빈 상태 평가를 수행하고 말라리아 탐지를 위한 두껍고 얇은 혈액 도말을 준비합니다. 장 기생충 확인을 위해 대변 샘플을 수집합니다.

III.7. 혈액 샘플 처리 전체 신체 저장소 분석에 참여하는 60명의 어린이에 대해 7~12세 어린이를 대상으로 하며 기본 대상 특성을 얻습니다. 기준선에서 각 어린이에게 공복 정맥 혈액 샘플(7mL)을 채취합니다. 그 후, 이들에게 1.0 μmol [14,15]-13C2-레티닐 아세테이트를 경구 투여할 것이며, 이는 공개된 대로 합성되고(Tanumihardjo, 2001), 콩기름에 용해되고 250 microL 양성 치환 피펫으로 투여됩니다. 복용 후 즉시 흡수를 돕기 위해 올리브 오일 1티스푼을 투여합니다. 아이들은 흰 빵과 초콜릿 맛 헤이즐넛 페이스트로 구성된 표준화된 아침 식사를 먹게 됩니다. 후속 혈액은 투여 후 14일째 오로다라 병원 간호사가 채취하여 즉시 얼음 위에 보관한 후 처리를 위해 보보-디울라소에 위치한 Institut de Recherche en Sciences de la Santé로 운반됩니다.

동일한 그룹의 학생 60명의 혈청 샘플을 3개의 튜브에 분취하여 -80°C에서 냉동합니다.

모든 샘플은 아래에 설명된 대로 가스 크로마토그래피-연소-동위원소 비율 질량 분석법(GCCIRMS)을 통한 분석을 위해 위스콘신 대학교 매디슨(UW)으로 배송되거나 직접 운반됩니다.

낮은 샘플량에 대해 아래 설명된 대로 기준 혈액 샘플에서 혈청 레티닐 에스테르 및 카로티노이드에 대해서도 분석됩니다.

과거 부르키나파소에서도 유사한 방법이 사용되었는데(Bationo et al., 2018), 이는 야채 섭취량이 낮은 것으로 나타났습니다. 그러나 비타민 A 강화 오일은 해당 연구가 완료된 이후 현재 국내에서 널리 이용 가능해졌습니다. 이 연구는 비타민 A 과잉의 척도로서 혈청 레티닐 에스테르의 검증에 가치를 더할 것입니다.

혈청에서 레티놀을 사전 정제하는 방법은 인체 생물학적 시료(혈청) 배송에 따른 추가 규제 부담을 피하기 위해 하나의 분취량에서 방부제를 사용하는 고체상 추출(SPE) 방법을 사용하여 조사됩니다. 우리는 먼저 위스콘신 대학교(매디슨)에서 최적의 프로토콜을 결정할 것입니다. 파일럿 연구에서는 NH2 컬럼과 헥산/에틸 아세테이트 용매를 사용하는 순상 SPE가 혈청에서 매우 높은 회수율과 레티놀 순도를 갖는 것으로 나타났으며, 보존제로서 부틸화 하이드록시톨루엔과 알파-토코페롤을 조사할 것입니다. 현장에서 SPE 사전정제를 사용하는 경우 GCCIRMS에 도입하기 전에 HPLC로 레티놀을 재정제할 계획이므로 어떤 보존제가 HPLC 재정제 및 분석을 방해하지 않는지 결정할 것입니다.

RID 기술이 투여 시 염증에 의해 어떻게 영향을 받는지 탐색하기 위한 3~4세의 아프리카 미취학 아동을 대상으로 한 기존 데이터 세트입니다. 염증에 의해 혈청 레티놀과 레티놀 결합 단백질이 일시적으로 감소한다는 것은 잘 알려져 있다(Filteau et al., 1993; Thurnham et al., 2003). 이는 임상적 또는 무증상 감염 수준이 높은 집단의 비타민 A 상태 추정에 영향을 미칠 수 있습니다(Suri et al., 2015; 2021). 그러나 RID에 대한 염증의 잠재적 영향은 대규모 어린이 그룹에서 평가되지 않았습니다. 우리는 부르키나 파소, 에티오피아, 카메룬, 남아프리카 및 탄자니아 어린이들의 전신 비타민 A 매장량을 계산했습니다. 염증 상태는 투여 당시 혈액 샘플에서 채취한 C반응성 단백질(CRP)과 알파1산당단백질(AGP)을 측정하여 평가되었습니다. 13C-RID 테스트를 기반으로 한 총 간 보유량(TLR)과 CRP 및 AGP의 연속 값 사이의 연관성을 살펴보고 관계의 기울기가 0이 아닌지 테스트합니다. 또한 염증의 다음 4가지 범주, 즉 염증 없음, 잠복기(상승된 CRP(>5mg/L)만), 초기 회복기(상승된 CRP 및 AGP(>1g/L))를 사용하여 TLR에 대한 범주형 평균을 비교할 것입니다. 그룹 간 차이에 대한 ANOVA 테스트를 사용하여 후기 회복기(AGP만 상승).

MRDR 테스트와 관련된 두 번째 단면 연구에서는 여전히 7~12세 어린이를 대상으로 하며, 아날로그를 사용하여 흡수 곡선을 평가하고 흡수 곡선에 캡슐을 사용하여 차이가 있는지 확인하기 위해 기본 피험자 특성을 얻을 것입니다.

이 연구에서는 오일에 직접 경구 투여하는 것과 비교하여 캡슐에 함유된 표지된 레티닐 아세테이트와 유사하게 3,4-디데히드로레티닐 아세테이트의 흡수를 조사할 것입니다. 위에서 언급한 것과 동일한 인식 및 감작 절차를 사용하여 어린이를 15명씩 6개 그룹으로 분리하고 0~7시간 후의 혈액 샘플 수집 시점을 달리하여 캡슐 투여 또는 직접적인 경구 투여에 무작위로 배정합니다. 모든 샘플은 3,4-디데히드로레티놀 및 3,4-디데히드로레티닐 에스테르에 대해 분석됩니다. 알코올 형태는 레티놀 결합 단백질(RBP)에 결합된 형태와 동일하며, 에스테르는 흡수 곡선을 반영합니다.

모든 어린이는 약 200μL의 대두유에 용해된 7.0μmole의 3,4-디데히드로레티닐 아세테이트를 섭취하게 됩니다. MRDR 테스트의 비타민 A 결핍 기준치는 0.060이며, 이는 투여 후 4~6시간 후의 3,4-디데히드로레티놀 대 레티놀 비율입니다. 그러므로 각 어린이는 이 측정값을 갖게 됩니다. 2~5시간 사이의 에스테르 흡수 곡선 아래 면적은 경구 투여량에 따른 카일로미크론 분포를 나타냅니다. 모든 샘플은 MRDR에 대한 표준 250μL 방법과 3,4-디데히드로레티놀 및 3,4-디데히드로레티닐 에스테르에 대한 확장 UPLC 방법을 사용하여 분석됩니다.

연구는 두 단계로 진행됩니다:

첫 번째 단계는 망고 시즌(11~12월) 이후에 수행될 예정이며, 두 번째 단계의 연구는 망고 시즌(4~5월) 동안 수행될 예정입니다.

III.8. 실험실 분석

가스 크로마토그래피-연소-동위원소 비율 질량 분석법(GCCIRMS)을 통한 샘플 분석:

혈청: GCCIRMS 분석을 위한 혈청 추출 절차 및 장비는 이전에 보고되었습니다(Howe et al., 2009; Gannon et al., 2014). 간단히 말해서, 혈청을 실온에서 해동시켰습니다. 0.75 mL(또는 사용 가능한 모든) 혈청에 에탄올(1 x vol)을 첨가하여 단백질을 침전시키고 C23 베타-아포-카로테놀을 내부 표준으로 첨가한 후 3 x 1 mL 헥산 추출을 수행합니다. 헥산을 모으고, 질소 하에 건조시키고, 100 μL 메탄올에 재현탁하고, -80⁰C에서 ~5분 동안 동결하고, 잠시 원심분리한 후 정량화 및 정제를 위해 HPLC 시스템 1에 주입합니다. 시스템 1은 92:8 아세토니트릴:물(1.0mL/분)을 사용하는 Gracesmart C18(5μm, 4.6 x 250mm) 컬럼입니다. 레티놀 분획을 수집하고 질소하에 건조시킨 후 시스템 2에 주입하기 위해 100μL 메탄올에 재현탁시켰습니다. 시스템 2는 0.7mL/분의 속도로 100% 메탄올을 사용하는 동일한 컬럼입니다. 레티놀 분획을 수집하고 SPD1010 SpeedVac을 사용하여 진공 하에서 건조시킨 다음 4-6 μL 헥산에 재현탁시키고 1-3 μL를 GC에 주입합니다(약 75ng 주입). GC/C/IRMS 시스템이 공개되었습니다(Howe et al., 2009). 원자%(At%)는 자당 표준(NIST, 8542)에 대해 보정된 이산화탄소를 기준으로 직접 계산됩니다(Isodat 버전 2.0).

레티닐 에스테르 및 카로티노이드 분석: 혈청 카로티노이드 및 레티닐 에스테르는 위스콘신대학교 매디슨 영양과학과 실험실에서 발표된 대로 초고성능 액체 크로마토그래피(Waters UPLC®)를 통해 분석됩니다(Williams et al., 2021). 이전에 설명한 용매 시스템(Gannon et al., 2018)은 적은 시료량과 원하는 분석물질에 최적화되었습니다. 간단히 말해서, 150 μL 혈청 또는 사용 가능한 모든 혈청을 100 μL C-23 β-아포-카로테놀(325 nm에서 메탄올 ~1.0의 내부 표준 광학 밀도)과 225 μL 에탄올이 들어 있는 붕규산 유리 튜브(Fisher Scientific)에 분주합니다. 추가되었습니다. 유기 화합물을 500 μL 헥산으로 3회 추출하고 와류와 혼합한 후 1200 중력의 상대 원심력에서 5분 동안 원심분리합니다. 풀링된 헥산 층은 질소 흐름 하에 원추형 바닥 유리 튜브에서 건조됩니다. 건조된 추출물을 75:25 메탄올:디클로로에탄 농도 75μL에 재현탁시키고 UPLC 바이알(Waters)로 옮기고 6μL를 UPLC 시스템에 주입합니다.

III.9. 프로젝트 완료를 위한 유기합성. 목표 1과 2의 완성을 위한 13C-레티닐 아세테이트의 합성. 13C2-레티닐 아세테이트는 Tanumihardjo(2001)에 의해 자세히 발표된 절차를 사용하여 합성될 것입니다. 간단히 말하면, C18-테트라엔 케톤은 상업적으로 이용 가능한 전구체인 β-이오논으로부터 합성되고 조심스럽게 정제됩니다. 수정된 Whittig-Horner 절차를 사용하여 C-18 테트라엔 케톤을 13C2 표지 트리에틸포스포노아세테이트의 탄소 음이온과 반응하여 레티놀 잔기의 골격에 2-13C를 추가합니다. 생성된 에틸 에스테르는 알코올로 환원되고 아세트산 무수물을 사용하여 13C2-레티닐 아세테이트로 에스테르화됩니다. 합성 올트랜스 이성질체는 상대적으로 무해하고 휘발성이 높은 유기 용매(예: 헥산 및 디에틸 에테르)를 사용하여 8% 물 비활성화 알루미나에서 조심스럽게 정제됩니다. 생성된 제제는 UV-VIS 분광학, TLC 및 HPLC를 사용하여 특성화됩니다. 장기 보관을 위해 14,15-13C2-레티닐 아세테이트를 콩기름에 녹여 -80oC에서 보관합니다. 우리는 연구 직전에 최종 용량의 콩기름(~200μL/용량)을 준비하여 각 연구 현장으로 직접 가져갈 것입니다.

목표 4의 완성을 위한 3,4-디데히드로레티닐 아세테이트 합성: Tanumihardjo 박사는 인구 기반 영양 평가에 사용하기 위해 조지아 주 애틀랜타에 있는 질병통제센터를 위해 일상적으로 3,4-디데히드로레티닐 아세테이트를 합성합니다. 따라서 우리는 동역학 연구에 등록한 산모의 유아에 대한 제안된 비타민 A 상태 평가를 위해 -80oC에 보관 중인 현재 회전 재고를 사용하는 데 문제가 있을 것으로 예상하지 않습니다. Tanumihardjo 실험실에서만 사용되는 합성 절차가 출판되었습니다(Barua and Ghosh 1972; Tanumihardjo, Barua, Olson, 1987). 간단히 말하면, 레티노산은 디아조메탄으로 메틸화됩니다. 생성된 메틸레티노에이트는 이산화망간으로 산화되어 4=옥소 메틸레티노에이트를 형성합니다. 신중한 정제 및 결정화 후에 4=옥소는 수소화붕소나트륨을 사용하여 4-OH 메틸레티노에이트로 환원됩니다. 며칠 동안 -30oC에서 헥산에서 결정화한 후, 4-OH는 p-톨루엔 설폰산으로 탈수되고 생성된 3,4-디데히드로-메틸레티노에이트는 정제되어 밤새 결정화됩니다. 마지막으로 3,4-디데히드로-메틸레티노에이트는 수소화알루미늄리튬을 사용하여 3,4-디데히드로레티놀로 환원되고 즉시 3,4-디데히드로레티닐 아세테이트로 아세틸화되고 정제되고 대두유에 용해된 후 용량이 준비되고 맞춤화될 때까지 -80oC에서 보관됩니다. 개별 연구를 위해.

III.6. 윤리적 허가 프로토콜 및 동의서 양식은 IRSS의 기관 검토 위원회에서 윤리적 검토를 받고 범아프리카 임상시험 등록소(www.pactr.org)에 등록됩니다. 고유 식별 번호로 데이터베이스를 관리합니다. 우리는 이미 어린이를 대상으로 RID 테스트를 수행한 경험이 있습니다(Bationo et al., 2019).

IV. 연구 작업 계획 시간 계획, IRSS 부르키나 파소 활동 1년 2년 3년 4년 Q1 Q2 Q3 Q4 Q1 Q2 Q3 Q4 Q1 Q2 Q3 Q4 Q1 Q2 Q3 Q4 프로토콜 확정 윤리적 검토 및 승인 SOP 개발 연구 장소 준비 연구 직원 선정 및 교육 1차 단면 연구 1차 시료 준비 및 보관 1차 단면 연구 2차 시료 준비 및 보관 시료 운송 2차 1차 단면 연구 시료 준비 및 보관 두 번째 단면 연구의 두 번째 라운드 시료 준비 및 보관 시료 배송 실험실 분석 데이터 처리 지역, 국가, 국제 전파