Validación y simplificación de la técnica de dilución de isótopos de retinol en escolares de Burkina Faso (RID_VAB)

Título del proyecto Validación y simplificación de la técnica de dilución de isótopos de retinol en escolares de Burkina Faso

I. Antecedentes y biomarcadores racionales del estado de la vitamina A que reflejan el estándar de oro, es decir, la biopsia hepática, están disponibles pero se están perfeccionando para aumentar la accesibilidad en aplicaciones basadas en la población. La prueba de dilución de isótopos de retinol (RID) es uno de esos biomarcadores. En Burkina Faso, pudimos evaluar una prueba de 7 días con una prueba de 14 días con la simple adición de un factor de corrección a la ecuación de predicción. Los valores de las reservas corporales totales de vitamina A fueron similares, pero la variación aumentó con el aumento de las reservas hepáticas. En el cálculo de las reservas hepáticas totales de vitamina A se confirmó que el 3% del peso corporal como peso del hígado en niños en edad escolar era apropiado. La simplificación de la dilución de isótopos para la evaluación de poblaciones y el desarrollo de capacidades para análisis de espectrometría de masas son áreas importantes del desarrollo de la nutrición para informar los programas de salud pública. Esta propuesta continuará perfeccionando el método para su uso generalizado.

II. El objetivo general Proporcionar nuevos conocimientos sobre cómo utilizar la técnica de dilución de isótopos de retinol en encuestas de población más amplias para evaluar el estado de la vitamina A desde la deficiencia hasta el exceso.

II.1. Objetivos específicos Se han esbozado varios objetivos específicos para este PCI. A través de la investigación que se llevará a cabo en Burkina Faso y en los conjuntos de datos existentes, nos centraremos en los siguientes objetivos específicos en escolares.

1. Definir un valor de reserva hepática total de exceso de vitamina A mediante la aplicación de datos de éster de retinilo sérico en ayunas en escolares con la prueba RID. 2. Examinar cómo se puede simplificar la metodología existente para adaptarla a las encuestas de población sin pérdida de precisión, utilizando técnicas de purificación de retinol in situ. 3. Explorar cómo la técnica de dilución de isótopos de retinol se ve afectada por la inflamación en el momento de la dosificación utilizando un conjunto de datos existente en niños africanos en edad preescolar 4. Examinar la diferencia en la absorción de Acetato de 3,4-dideshidroretinilo en forma oleosa y encapsulada en niños en edad escolar.

III. Método III.1. Lugar y población del estudio El estudio propuesto se llevará a cabo en una escuela primaria en la parte occidental de Burkina Faso, en Orodara, una aldea en el extremo exterior de Bobo Dioulasso, donde nos dirigiremos a niños de 7 a 12 años. La mayoría de los habitantes del pueblo son agricultores de ingresos medios y sus familias. Burkina Faso es uno de los países involucrados en el consorcio VITAAFRO (Vitamina A en África) que está interesado en determinar con precisión el estado de VA para informar las intervenciones y políticas existentes.

III.2. Diseño del estudio Se realizarán dos estudios transversales sucesivos durante un curso escolar. El primer estudio al comienzo del año escolar, que coincide con el final de la temporada de lluvias, y que también está fuera de la temporada de mangos, y el segundo estudio, 5 a 6 meses después, después de la primera serie de recopilación de datos, Durante la temporada de mangos, estos estudios se llevarán a cabo en una escuela primaria de la parte occidental de Burkina Faso, en Orodara, un pueblo en las afueras de Bobo Dioulasso.

III.3. Método de muestreo En total, se reclutará a 158 escolares de dos formas diferentes. En un primer momento se reclutará a un grupo de 60 escolares mediante un muestreo estratificado incluyendo niños del primero al último año de primaria y proporcionalmente a su número por clase. A este primer grupo de 60 escolares se les aplicará una prueba de dilución de isótopos de retinol (RID) para evaluar las reservas corporales totales y comparar los valores con las concentraciones séricas de éster de retinilo en ayunas al inicio del estudio.

Los 98 escolares restantes serán reclutados según un muestreo estratificado y proporcionalmente a su número por clase y divididos en dos grupos de 49 niños según el sexo (es decir, 49 mujeres y 49 hombres). En cada participante, se realizarán dos momentos de muestreo de sangre. Luego, el participante será asignado aleatoriamente para tomar muestras de sangre en H0, H2, H3, H4, H5 H6 H8, H10, H24, H72, H168 y H336 como se especifica a continuación. Se generará una lista de aleatorización utilizando tablas de números aleatorios. Hemos elegido realizar una aleatorización en bloques en lugar de simple porque el primer enfoque nos permitirá tener grupos de comparación imparciales que serán aproximadamente del mismo tamaño durante todo el ensayo. Al utilizar la aleatorización en bloques, siempre habrá un número casi igual de niños en cada grupo de estudio.

Para estos grupos de niños, se utilizará la prueba de respuesta a la dosis relativa modificada (MRDR), una medida cualitativa del estado de la vitamina A para investigar la absorción de acetato de 3,4-dideshidroretinilo.

H0 (5), H2 (5), H3 (5), H4 (11), H5 (11) H6 (11) H8 (10), H10 (10), H24 (5), H72 (5), H168 ( 10), H336 (10)

III.4. Conciencia y sensibilización de la comunidad Antes de comenzar el estudio, llevaremos a cabo una serie de reuniones con tomadores de decisiones clave y líderes comunitarios en el área de estudio como parte de los esfuerzos para crear conciencia y movilizar a la comunidad para el estudio. Estas reuniones de sensibilización y extensión comunitaria informarán a la comunidad sobre la existencia y el propósito del estudio, así como los beneficios no solo para sus comunidades sino también para el país y África en general. Se les explicarán los motivos de la elección del área para cada uno de los estudios en humanos y el diseño propuesto.

III.5. Reclutamiento y selección

Como proceso de selección, se elaborará una lista de los escolares elegibles a partir de los cuales se realizará la selección. Los niños serán elegibles para participar si cumplen con los siguientes criterios de selección:

III.5.1. Criterios de inclusión:

• Escolares de 7 a 12 años.
• El tutor o padre del niño está dispuesto a dar su consentimiento informado.
• La familia del niño planea permanecer residente en las áreas de estudio durante el período de estudio.

III.5.2. Criterios de exclusión:

• Evidencia clínica de deficiencia de vitamina A en mis en forme : Anglais (Royaume-Uni)a mis en forme : Anglais (États-Unis)a mis en forme : Anglais (États-Unis)a mis en forme : Anglais (États-Unis)
• Desnutrición grave (puntuación Z de peso para la edad (WAZ) o puntuación Z de talla para la edad (HAZ) <-3 DE)
• Enfermedades graves como tuberculosis e infección sintomática por VIH.
• Niño <6 años o >12 años III.6. Variables del estudio Después de evaluar la elegibilidad, se obtendrá el consentimiento informado del niño y su cuidador o padre. Recopilaremos información socioeconómica (p. ej. ingresos, educación, patrimonio familiar) y realizar mediciones antropométricas (peso, talla), evaluación del estado de hemoglobina y preparación de frotis sanguíneos gruesos y finos para la detección de malaria. Se recolectará una muestra de heces para la determinación de parásitos intestinales.

III.7. Procesamiento de muestras de sangre Para los 60 niños involucrados en el análisis de almacenamiento corporal total, nos centraremos en niños de 7 a 12 años y se obtendrán las características iniciales del sujeto. Al inicio del estudio, se extraerá una muestra de sangre venosa en ayunas (7 ml) de cada niño. Posteriormente, se les administrará una dosis oral de 1,0 μmol [14,15]-13C2-acetato de retinilo, que se sintetizará según lo publicado (Tanumihardjo, 2001), se disuelve en aceite de soja y se administra con una pipeta de desplazamiento positivo de 250 microL. A la dosis le seguirá inmediatamente una cucharadita de aceite de oliva para favorecer la absorción. Los niños tomarán un desayuno estandarizado a base de pan blanco y pasta de avellanas con sabor a chocolate. Las enfermeras de la clínica de Orodara recolectarán la sangre de seguimiento el día 14 después de la dosis, la almacenarán inmediatamente en hielo y la transportarán al Institut de Recherche en Sciences de la Santé ubicado en Bobo-Dioulasso para su procesamiento.

Las muestras de suero del mismo grupo de 60 escolares se dividirán en alícuotas en tres tubos y se congelarán a -80 grados C.

Todas las muestras se enviarán o se transportarán personalmente a la Universidad de Wisconsin-Madison (UW) para su análisis mediante espectrometría de masas de relación isotópica-cromatografía de gases (GCCIRMS) como se describe a continuación.

Las muestras de sangre de referencia también se analizarán en busca de ésteres de retinilo y carotenoides séricos como se describe a continuación para volúmenes de muestra bajos.

En Burkina Faso se ha utilizado en el pasado un método similar (Bationo et al., 2018), que reveló una baja ingesta de verduras. Sin embargo, el aceite fortificado con vitamina A ahora está ampliamente disponible en el país desde que se realizó ese estudio. Este estudio agregará valor a la validación de los ésteres de retinilo en suero como medida del exceso de vitamina A.

Se investigará una purificación previa de retinol a partir de suero utilizando métodos de extracción en fase sólida (SPE) con conservante de una alícuota para evitar la carga regulatoria adicional que supone el envío de muestras biológicas humanas (suero). Primero determinaremos los protocolos óptimos en la Universidad de Wisconsin - Madison. Los estudios piloto han sugerido que la SPE de fase directa que utiliza columnas de NH2 y disolventes de hexano/acetato de etilo tiene una recuperación y pureza muy altas del retinol del suero, e investigaremos el hidroxitolueno butilado y el alfa-tocoferol como conservantes. Si se utiliza la prepurificación con SPE en el campo, planearíamos repurificar el retinol mediante HPLC antes de su introducción en GCCIRMS, por lo que determinaremos qué conservante no interferirá con la repurificación y el análisis por HPLC.

Un conjunto de datos existente en niños africanos en edad preescolar de 3 a 4 años, para explorar cómo la técnica RID se ve afectada por la inflamación en el momento de la dosificación. Es bien sabido que el retinol sérico y la proteína fijadora de retinol disminuyen temporalmente debido a la inflamación (Filteau et al., 1993; Thurnham et al., 2003). Esto puede afectar las estimaciones del estado de la vitamina A en poblaciones con altos niveles de infecciones clínicas o subclínicas (Suri et al., 2015; 2021). Sin embargo, el efecto potencial de la inflamación sobre la EIR no se ha evaluado en un grupo grande de niños. Hemos calculado las reservas corporales totales de vitamina A en niños de Burkina Faso, Etiopía, Camerún, Sudáfrica y Tanzania. El estado de inflamación se evaluó midiendo la proteína C reactiva (PCR) y la glicoproteína ácida alfa1 (AGP) obtenidas de las muestras de sangre en el momento de la dosificación. Analizaremos la asociación entre las reservas hepáticas totales (TLR) según la prueba 13C-RID y los valores continuos de PCR y AGP, probando si la pendiente de la relación no es igual a cero. También compararemos medias categóricas para TLR utilizando las siguientes cuatro categorías de inflamación: sin inflamación, incubación (PCR elevada (>5 mg/L) solamente), convalecencia temprana (CRP y AGP elevadas (>1 g/L)), y convalecencia tardía (solo AGP elevada) utilizando una prueba ANOVA para diferencias entre grupos.

Para el segundo estudio transversal que involucra la prueba MRDR, todavía nos dirigiremos a niños de 7 a 12 años y se obtendrán las características iniciales del sujeto para evaluar las curvas de absorción usando un análogo y para determinar si hay una diferencia usando cápsulas en las curvas de absorción.

Este estudio investigará la absorción de acetato de 3,4-dideshidroretinilo como analogía con el acetato de retinilo marcado en cápsulas versus dosis orales directas en aceite. Utilizando los mismos procedimientos de concientización y sensibilización mencionados anteriormente, los niños serán separados en seis grupos de 15 y asignados aleatoriamente a la administración de cápsulas o dosis orales directas con diferentes momentos de recolección de muestras de sangre, de 0 a 7 horas después. Todas las muestras se analizarán en busca de ésteres de 3,4-didehidroretinol y 3,4-didehidroretinilo. La forma de alcohol equivaldrá a la que está unida a la proteína fijadora de retinol (RBP), mientras que los ésteres reflejarán las curvas de absorción.

Todos los niños recibirán 7,0 μmol de acetato de 3, 4-dideshidroretinilo disueltos en aproximadamente 200 μl de aceite de soja. El límite para la deficiencia de vitamina A para la prueba MRDR es 0,060, que es la proporción de 3,4-didehidroretinol a retinol entre 4 y 6 horas después de la dosificación. Por lo tanto, cada niño tendrá esta medida. El área bajo la curva de absorción del éster de 2 a 5 horas revelará la distribución de quilomicrones de la dosis oral. Todas las muestras se analizarán utilizando el método estándar de 250 μL para MRDR y un método UPLC extendido para ésteres de 3,4-didehidroretinol y 3,4-didehidroretinilo.

El estudio tendrá dos fases:

Una fase inicial se llevará a cabo después de la temporada de mangos (noviembre-diciembre) y una segunda fase del estudio se llevará a cabo durante la temporada de mangos (abril-mayo).

III.8. Análisis de laboratorio

Análisis de muestras mediante espectrometría de masas con relación de isótopos-cromatografía de gases-combustión (GCCIRMS):

Suero: Los procedimientos de extracción de suero y la instrumentación para el análisis GCCIRMS se han informado anteriormente (Howe et al., 2009; Gannon et al., 2014). Brevemente, suero nosotros descongelado a temperatura ambiente. A 0,75 ml (o todo el suero disponible), se agrega etanol (1 x vol) para precipitar las proteínas, se agrega beta-apocarotenol C23 como estándar interno y se realizan 3 extracciones con hexano de 1 ml. Los hexanos se combinan, se secan bajo nitrógeno, se resuspenden en 100 μl de metanol, se congelan a -80⁰C durante aproximadamente 5 minutos, se centrifugan brevemente y se inyectan en el sistema 1 de HPLC para su cuantificación y purificación. El sistema 1 es una columna Gracesmart C18 (5 μm, 4,6 x 250 mm) con acetonitrilo:agua 92:8 a 1,0 ml/min. La fracción de retinol se recogió, se secó bajo nitrógeno y se resuspendió en 100 µl de metanol para inyección en el sistema 2. El sistema 2 es una columna idéntica con metanol al 100 % a 0,7 ml/min. La fracción de retinol se recoge, se seca al vacío con un SPD1010 SpeedVac, se resuspende en 4-6 μl de hexano y se inyectan 1-3 μl (para inyectar aproximadamente 75 ng) en el GC. Se publicó el sistema GC/C/IRMS (Howe et al., 2009). El % de átomos (At%) se calcula directamente (Isodat versión 2.0) en referencia al dióxido de carbono, que se calibra con un estándar de sacarosa (NIST, 8542).

Análisis de ésteres de retinilo y carotenoides: los carotenoides séricos y los ésteres de retinilo se analizarán según lo publicado (Williams et al., 2021) en el laboratorio del Departamento de Ciencias de la Nutrición de la Universidad de Wisconsin-Madison mediante cromatografía líquida de ultra rendimiento (Waters UPLC®) de acuerdo con un sistema disolvente descrito anteriormente (Gannon et al., 2018), optimizado para volúmenes de muestra bajos y analitos deseados. Brevemente, se colocan alícuotas de 150 µL de suero, o todo el disponible, en tubos de vidrio de borosilicato (Fisher Scientific) a los que se añaden 100 µL de β-apocarotenol C-23 (densidad óptica estándar interna en metanol ~1,0 a 325 nm) y 225 µL de etanol. agregado. Los compuestos orgánicos se extraen tres veces con 500 µL de hexanos, se mezclan con un vórtex y se centrifugan con una fuerza centrífuga relativa de 1200 unidades de gravedad durante 5 min. Las capas de hexano reunidas se secan en tubos de vidrio de fondo cónico bajo una corriente de nitrógeno. El extracto seco se resuspende en 75 µl de concentración de metanol:dicloroetano 75:25, se transfiere a viales de UPLC (Waters) y se inyectan 6 µl en el sistema UPLC.

III.9. Síntesis orgánica para la finalización del proyecto. Síntesis de acetato de 13C-retinilo para completar los objetivos 1 y 2. El acetato de 13C2-retinilo se sintetizará mediante un procedimiento que ha sido publicado en detalle por Tanumihardjo (2001). Brevemente, la tetraenocetona C18 se sintetiza a partir de β-ionona, un precursor disponible comercialmente, y se purifica cuidadosamente. Usando un procedimiento de Whittig-Horner modificado, la tetraenocetona C-18 se hace reaccionar con el carbanión de trietilfosponoacetato marcado con 13C2 para agregar 2-13C a la cadena principal del resto de retinol. El éster etílico resultante se reduce al alcohol y se esterifica a acetato de retinilo 13C2 con anhídrido acético. El isómero totalmente trans sintético se purifica cuidadosamente en alúmina desactivada con agua al 8% usando disolventes orgánicos relativamente inocuos y altamente volátiles, por ejemplo, hexanos y éter dietílico. La preparación resultante se caracteriza mediante espectroscopia UV-VIS, TLC y HPLC. Para el almacenamiento a largo plazo, el acetato de 14,15-13C2-retinilo se almacena disuelto en aceite de soja a -80oC. Prepararemos las dosis finales en aceite de soja (~200 μL/dosis) poco antes del estudio y las llevaremos personalmente a cada sitio del estudio.

Síntesis de acetato de 3,4-dideshidroretinilo para completar el Objetivo 4: El Dr. Tanumihardjo sintetiza de forma rutinaria acetato de 3,4-dideshidroretinilo para que los Centros para el Control de Enfermedades de Atlanta, Georgia, lo utilicen en sus evaluaciones nutricionales basadas en la población. Por lo tanto, no prevemos un problema en el uso de existencias rotativas actuales que están almacenadas a -80oC para la evaluación propuesta del estado de la vitamina A en los bebés de las madres inscritas en el estudio cinético. Los procedimientos sintéticos utilizados exclusivamente en el laboratorio de Tanumihardjo están publicados (Barua y Ghosh 1972; Tanumihardjo, Barua, Olson, 1987). Brevemente, el ácido retinoico se metila con diazometano. El metilretinoato resultante se oxida con dióxido de manganeso para formar 4=oxometilretinoato. Después de una cuidadosa purificación y cristalización, el 4=oxo se reduce a 4-OH metilretinoato usando borohidruro de sodio. Después de la cristalización en hexanos a -30oC durante varios días, el 4-OH se deshidrata con ácido p-toluenosulfónico y el 3,4-dideshidrometilretinoato resultante se purifica y se deja cristalizar durante la noche. Finalmente, el 3,4-dideshidro-metilretinoato se reduce a 3,4-dideshidroretinol con hidruro de litio y aluminio y se acetila inmediatamente a acetato de 3,4-dideshidroretinilo, se purifica, se disuelve en aceite de soja y se almacena a -80oC hasta que se preparen y personalicen las dosis. para estudios individuales.

III.6. Autorización ética Los protocolos y los formularios de consentimiento informado se someterán a una revisión ética en las Juntas de Revisión Institucional del IRSS y se registrarán en el Registro Panafricano de Ensayos Clínicos (www.pactr.org) base de datos bajo un número de identificación único. Ya tenemos experiencia trabajando con el test RID en niños (Bationo et al., 2019).

IV. Plan de trabajo del estudio Plan de tiempo, IRSS Burkina Faso Actividades Año 1 Año 2 Año 3 Año 4 Q1 Q2 Q3 Q4 Q1 Q2 Q3 Q4 Q1 Q2 Q3 Q4 Q1 Q2 Q3 Q4 Finalización del protocolo Revisión y aprobación ética Desarrollo de SOP Preparación del sitio del estudio Selección y capacitación del personal del estudio Primera ronda del primer estudio transversal Preparación y almacenamiento de muestras Segunda ronda del primer estudio transversal Preparación y almacenamiento de muestras Envío de muestras Primera ronda del segundo estudio transversal Preparación y almacenamiento de muestras Segunda ronda del segundo estudio transversal Preparación y almacenamiento de muestras Envío de muestras Análisis de laboratorio Manejo de datos Difusiones locales, nacionales, internacionales