Validering og forenkling af retinol-isotopfortyndingsteknikken hos burkinske skolebørn (RID_VAB)

Projekttitel Validering og forenkling af retinol isotopfortyndingsteknikken hos burkinske skolebørn

I. Baggrund og rationelle biomarkører for vitamin A-status, der afspejler guldstandarden, dvs. leverbiopsi, er tilgængelige, men undergår forfining for at øge tilgængeligheden i befolkningsbaserede applikationer. Retinol isotopfortynding (RID) test er en sådan biomarkør. I Burkina Faso var vi i stand til at evaluere en 7-d test med en 14-d test med den simple tilføjelse af en korrektionsfaktor til forudsigelsesligningen. Værdierne for kroppens samlede A-vitaminlagre var ens, men variationen steg med stigende leverreserver. Antagelsen om 3 % af kropsvægten som levervægt hos børn i skolealderen blev bekræftet som passende i beregningen for de samlede A-vitaminreserver i leveren. Forenkling af isotopfortynding til populationsevaluering og opbygning af kapacitet til massespektrometrianalyser er vigtige områder i ernæringsudviklingen for at informere folkesundhedsprogrammer. Dette forslag vil fortsætte med at forfine metoden til udbredt brug.

II. Det overordnede mål At give ny viden om, hvordan man anvender retinol isotopfortyndingsteknikken i større befolkningsundersøgelser til at vurdere vitamin A-status fra mangel til overskud.

II.1. Specifikke mål Adskillige specifikke mål er blevet skitseret for denne CRP. Gennem den forskning, der vil blive udført i Burkina Faso og på eksisterende datasæt, vil vi fokusere på følgende specifikke mål for skolebørn.

1. At definere en overskydende total leverreserveværdi for vitamin A ved at anvende fastende serumretinylesterdata hos skolebørn med RID-test 2. At undersøge, hvordan den eksisterende metodologi kan forenkles, så den passer til befolkningsundersøgelser uden tab af nøjagtighed, ved hjælp af retinoloprensningsteknikker på stedet 3. At undersøge, hvordan retinol isotopfortyndingsteknikken påvirkes af inflammation på doseringstidspunktet ved hjælp af et eksisterende datasæt på afrikansk førskolebørn 4. At undersøge forskellen i absorption af 3,4-didehydroretinylacetat fra olie og i indkapslet form hos børn i skolealderen.

III. Metode III.1. Undersøgelsessted og befolkning Den foreslåede undersøgelse vil blive udført i en folkeskole i den vestlige del af Burkina Faso i Orodara, en landsby i yderkanten af ​​Bobo Dioulasso, hvor vi vil målrette børn i alderen 7 til 12 år. De fleste indbyggere i landsbyen er middelindkomstbønder og deres familier. Burkina Faso er et af de lande, der er involveret i konsortiet VITAAFRO (Vitamin A i Afrika), som er interesseret i nøjagtigt at bestemme VA-status for at informere om eksisterende interventioner og politikker.

III.2. Studiedesign To på hinanden følgende tværsnitsundersøgelser vil blive udført i løbet af et skoleår. Den første undersøgelse i begyndelsen af ​​skoleåret, som tilfældigvis er slutningen af ​​regnsæsonen, og som også er uden for mangosæsonen, og den anden undersøgelse, 5 til 6 måneder senere, efter det første sæt dataindsamling, i løbet af mangosæsonen vil disse undersøgelser blive udført i en folkeskole i den vestlige del af Burkina Faso i Orodara, en landsby i den ydre udkant af Bobo Dioulasso.

III.3. Stikprøvemetode I alt vil 158 skolebørn blive rekrutteret på to forskellige måder. I første omgang vil en gruppe på 60 skolebørn blive rekrutteret gennem en stratificeret stikprøve, der inkluderer børn fra første til sidste grundskoleår og proportionalt med deres antal pr. klasse. Til denne første gruppe på 60 skolebørn vil der blive anvendt en retinol isotopfortynding (RID) test til total body store vurdering for at sammenligne værdierne med fastende serum retinyl ester koncentrationer ved baseline.

De resterende 98 skolebørn vil blive rekrutteret i henhold til stratificeret stikprøve og proportionalt med deres antal pr. klasse og opdelt i to grupper på 49 børn efter køn (dvs. 49 tæver og 49 mænd). For hver deltager vil der blive udført to tidspunkter for blodprøvetagning. Deltageren vil derefter blive tilfældigt tildelt til at tage blodprøver ved H0, H2, H3, H4, H5 H6 H8, H10, H24, H72, H168 og H336 som specificeret nedenfor. En randomiseringsliste vil blive genereret ved hjælp af tabeller med tilfældige tal. Vi har valgt at lave blokering frem for simpel randomisering, fordi den førstnævnte tilgang vil give os mulighed for at have upartiske sammenligningsgrupper, der vil have nogenlunde samme størrelse gennem hele forsøget. Ved at bruge blokrandomisering vil der altid være næsten lige mange børn i hver undersøgelsesgruppe.

Til disse grupper af børn vil den modificerede relative dosis-respons (MRDR)-test, et kvalitativt mål for vitamin A-status blive brugt til at undersøge absorptionen af ​​3,4-didehydroretinylacetat.

H0 (5), H2 (5), H3 (5), H4 (11), H5 (11) H6 (11) H8 (10), H10 (10), H24 (5), H72 (5), H168 ( 10), H336 (10)

III.4. Samfundsbevidsthed og sensibilisering Inden studiestart vil vi gennemføre en række møder med centrale beslutningstagere og samfundsledere på studieområdet som led i bestræbelserne på at øge bevidstheden og mobilisere samfundet til undersøgelsen. Disse møder for opsøgende lokalsamfund og sensibilisering vil informere samfundet om eksistensen og formålet med undersøgelsen samt fordelene ikke kun for deres lokalsamfund, men også for landet og Afrika som helhed. Årsagerne til at vælge området for hver af de menneskelige undersøgelser og det foreslåede design vil blive forklaret for dem.

III.5. Rekruttering og screening

Som en screeningsproces vil der blive lavet en liste over de berettigede skoleelever, hvorfra udvælgelsen vil blive foretaget. Børn vil være berettiget til at deltage, hvis de opfylder følgende screeningskriterier:

III.5.1. Inklusionskriterier:

• Skolebørn i alderen 7-12 år
• Barnets værge eller forælder er villig til at give informeret samtykke
• Barnets familie planlægger at blive boende i undersøgelsesområderne i løbet af undersøgelsesperioden

III.5.2. Eksklusionskriterier:

• Klinisk bevis for vitamin A-mangel a mis en forme : Anglais (Royaume-Uni)a mis en forme : Anglais (États-Unis)a mis en forme : Anglais (États-Unis)a mis en forme : Anglais (États-Unis)
• Alvorlig underernæring (vægt-for alder Z-score (WAZ) eller højde-for-alder Z-score (HAZ) <-3 SD)
• Alvorlige sygdomme, herunder tuberkulose, symptomatisk HIV-infektion
• Barn <6 år eller >12 år III.6. Undersøgelsesvariable Efter screening for berettigelse vil der blive indhentet informeret samtykke fra barnet og dets omsorgsperson eller forælder. Vi vil indsamle socioøkonomiske oplysninger (f. indkomst, uddannelse, familieaktiver) og udføre antropometriske målinger (vægt, højde), vurdering af hæmoglobinstatus og forberede tykke og tynde blodudstrygninger til malariadetektion. En afføringsprøve vil blive indsamlet til bestemmelse af tarmparasitter.

III.7. Behandling af blodprøver For de 60 børn, der er involveret i total body store-analysen, vil vi målrette mod børn i alderen 7 til 12 år, og baseline-emnekarakteristika vil blive opnået. Ved baseline vil der blive udtaget en fastende venøs blodprøve (7 ml) på hvert barn. Derefter vil de blive givet en oral dosis på 1,0 μmol [14,15]-13C2-retinylacetat, som vil blive syntetiseret som offentliggjort (Tanumihardjo, 2001), opløst i sojaolie og administreret med en 250 mikroL positiv forskydningspipette. Dosis vil straks blive efterfulgt af en teskefuld olivenolie for at hjælpe med optagelsen. Børn vil spise en standardiseret morgenmad med hvidt brød og hasselnøddepasta med chokoladesmag. Opfølgningsblodet vil blive indsamlet af Orodaras kliniksygeplejersker på dag 14 efter dosis, opbevaret straks på is og transporteret til Institut de Recherche en Sciences de la Santé i Bobo-Dioulasso til behandling.

Serumprøverne fra den samme gruppe på 60 skolebørn opdeles i tre rør og fryses ved -80 grader C.

Alle prøver vil blive sendt eller håndbåret til University of Wisconsin-Madison (UW) til analyse ved gaskromatografi-forbrænding-isotopforhold massespektrometri (GCCIRMS) som beskrevet nedenfor.

Baseline-blodprøverne vil også blive analyseret for serumretinylestere og carotenoider som beskrevet nedenfor for lave prøvevolumener.

Lignende metode er tidligere blevet brugt i Burkina Faso (Bationo et al., 2018), hvilket afslørede lavt grøntsagsindtag. Men A-vitamin beriget olie er nu blevet bredt tilgængelig i landet, siden den undersøgelse blev udført. Denne undersøgelse vil tilføje værdi til valideringen af ​​serumretinylestere som et mål for vitamin A-overskud.

En præ-oprensning af retinol fra serum vil blive undersøgt ved hjælp af fast-fase ekstraktion (SPE) metoder med konserveringsmiddel fra en alikvot for at undgå den ekstra regulatoriske byrde ved at sende humane biologiske prøver (serum). Vi vil først bestemme optimale protokoller ved University of Wisconsin - Madison. Pilotundersøgelser har antydet, at fremadfase SPE ved brug af NH2-søjler og hexan/ethylacetat-opløsningsmidler har meget høj genvinding og renhed af retinol fra serum, og vi vil undersøge butyleret hydroxytoluen og alfa-tocopherol som konserveringsmidler. Hvis SPE-foroprensning anvendes i marken, ville vi planlægge at genoprense retinolen ved HPLC før introduktion i GCCIRMS, så vi vil bestemme, hvilket konserveringsmiddel der ikke vil forstyrre HPLC-genoprensning og analyse.

Et eksisterende datasæt i afrikanske førskolebørn i alderen 3 til 4 år for at udforske, hvordan RID-teknikken påvirkes af inflammation på doseringstidspunktet. Det er velkendt, at serumretinol og retinolbindende protein midlertidigt reduceres ved inflammation (Filteau et al., 1993; Thurnham et al., 2003). Dette kan påvirke estimater af vitamin A-status i populationer med høje niveauer af kliniske eller subkliniske infektioner (Suri et al., 2015; 2021). Imidlertid er den potentielle effekt af inflammation på RID ikke blevet evalueret hos en stor gruppe børn. Vi har beregnet kroppens samlede A-vitaminlagre hos børn fra Burkina Faso, Etiopien, Cameroun, Sydafrika og Tanzania. Inflammationsstatus er blevet vurderet ved at måle C-reaktivt protein (CRP) og alpha1-syre-glycoprotein (AGP) opnået fra blodprøverne på tidspunktet for dosering. Vi vil se på sammenhængen mellem totale leverreserver (TLR) baseret på 13C-RID-testen og kontinuerlige værdier af CRP og AGP, og tester, om forholdets hældning ikke er lig med nul. Vi vil også sammenligne kategoriske middelværdier for TLR ved hjælp af følgende fire kategorier af inflammation: ingen inflammation, inkubation (kun forhøjet CRP (>5 mg/L)), tidlig rekonvalescens (forhøjet CRP og AGP (>1 g/L)) og sen rekonvalescens (kun forhøjet AGP) ved hjælp af en ANOVA-test for forskelle mellem grupper.

For den anden tværsnitsundersøgelse, der involverer MRDR-test, vil vi stadig målrette børn i alderen 7 til 12 år, og baseline-personkarakteristika vil blive opnået for at evaluere absorptionskurver ved hjælp af en analog og for at bestemme, om der er en forskel ved hjælp af kapsler i absorptionskurverne.

Denne undersøgelse vil undersøge absorptionen af ​​3,4-didehydroretinylacetat som en analogi til mærket retinylacetat i kapsler versus direkte orale doser i olie. Ved at bruge de samme bevidstheds- og sensibiliseringsprocedurer som nævnt ovenfor, vil børn blive opdelt i seks grupper på 15 og tilfældigt tildelt kapseladministration eller direkte oral dosis med forskellige tidspunkter for blodprøvetagning, fra 0 til 7 timer senere. Alle prøver vil blive analyseret for 3,4-didehydroretinol- og 3,4-didehydroretinylestere. Alkoholformen vil svare til den, der er bundet til retinolbindende protein (RBP), mens esterne vil afspejle absorptionskurverne.

Alle børn vil modtage 7,0 μmol 3, 4-didehydroretinylacetat opløst i ca. 200 μL sojaolie. Skæringsgrænsen for vitamin A-mangel for MRDR-testen er 0,060, hvilket er forholdet mellem 3,4-didehydroretinol og retinol 4 til 6 timer efter dosering. Derfor vil hvert barn have denne måling. Området under esterabsorptionskurven fra 2 til 5 timer vil afsløre chylomikronfordelingen fra den orale dosis. Alle prøver vil blive analyseret ved hjælp af standard 250 μL metoden for MRDR og en udvidet UPLC metode for 3,4-didehydroretinol og 3,4-didehydroretinyl estere.

Undersøgelsen vil have to faser:

En indledende fase vil blive udført efter mangosæsonen (november-december), og en anden fase af undersøgelsen vil blive udført i mangosæsonen (april-maj).

III.8. Laboratorieanalyse

Analyse af prøver ved gaskromatografi-forbrænding-isotopforhold massespektrometri (GCCIRMS):

Serum: Serumekstraktionsprocedurer og instrumentering til GCCIRMS-analyse er tidligere blevet rapporteret (Howe et al., 2009; Gannon et al., 2014). Kort sagt, serum os optøet ved stuetemperatur. Til 0,75 ml (eller alt tilgængeligt) serum tilsættes ethanol (1 x vol) for at udfælde proteiner, C23 beta-apo-carotenol tilsættes som en intern standard, og 3 x 1 ml hexanekstraktioner udføres. Hexaner samles, tørres under nitrogen, resuspenderes i 100 μL methanol, fryses ved -80 ⁰C i ~5 minutter, centrifugeres kort og injiceres på HPLC-system 1 til kvantificering og oprensning. System 1 er en Gracesmart C18 (5 μm, 4,6 x 250 mm) søjle med 92:8 acetonitril:vand ved 1,0 ml/min. Retinolfraktionen blev opsamlet, tørret under nitrogen og resuspenderet i 100 μL methanol til injektion på system 2. System 2 er en identisk søjle med 100 % methanol ved 0,7 ml/min. Retinolfraktionen opsamles, tørres under vakuum med en SPD1010 SpeedVac, resuspenderes i 4-6 μL hexan, og 1-3 μL injiceres (for at injicere ca. 75 ng) på GC. GC/C/IRMS-systemet blev offentliggjort (Howe et al., 2009). Atom % (At%) er direkte beregnet (Isodat version 2.0) med reference til kuldioxid, som er kalibreret mod en saccharosestandard (NIST, 8542).

Retinylester og carotenoidanalyse: Serumcarotenoider og retinylestere vil blive analyseret som offentliggjort (Williams et al., 2021) ved University of Wisconsin-Madison Department of Nutritional Sciences laboratorium ved ultra-performance væskekromatografi (Waters UPLC®) i henhold til en tidligere beskrevet opløsningsmiddelsystem (Gannon et al., 2018), optimeret til lave prøvevolumener og ønskede analytter. Kort fortalt fordeles 150 μL serum, eller alt tilgængeligt, i borosilikatglasrør (Fisher Scientific), hvortil 100 μL C-23 β-apo-carotenol (intern optisk standarddensitet i methanol ~1,0 ved 325 nm) og 225 μL ethanol er ethanol. tilføjet. Organiske forbindelser ekstraheres tre gange med 500 μL hexaner, blandes med en vortex og centrifugeres ved en relativ centrifugalkraft på 1200 tyngdeenheder i 5 min. Poolede hexanlag tørres i glasrør med konisk bund under en strøm af nitrogen. Den tørrede ekstrakt resuspenderes i 75 μL 75:25 methanol:dichlorethan-koncentration, overføres til UPLC-hætteglas (Waters) og 6 μL injiceres i UPLC-systemet.

III.9. Organisk syntese til gennemførelse af projektet. Syntese af 13C-retinylacetat til gennemførelse af mål 1 og 2. 13C2-retinylacetat vil blive syntetiseret ved hjælp af en procedure, der er blevet offentliggjort i detaljer af Tanumihardjo (2001). Kort fortalt syntetiseres C18-tetraenketon fra β-ionon, en kommercielt tilgængelig precursor, og renses omhyggeligt. Ved anvendelse af en modificeret Whittig-Horner-procedure omsættes C-18-tetraenketon med carbanionen af ​​13C2-mærket triethylphosponoacetat for at tilsætte 2-13C'er til retinoldelens rygrad. Den resulterende ethylester reduceres til alkoholen og esterificeres til 13C2-retinylacetat med eddikesyreanhydrid. Den syntetiske all-trans-isomer renses omhyggeligt på 8%-vand-deaktiveret aluminiumoxid ved hjælp af relativt uskadelige, meget flygtige, organiske opløsningsmidler, f.eks. hexaner og diethylether. Det resulterende præparat karakteriseres ved anvendelse af UV-VIS-spektroskopi, TLC og HPLC. Til langtidsopbevaring opbevares 14,15-13C2-retinylacetatet opløst i sojaolie ved -80oC. Vi vil forberede de endelige doser i sojabønneolie (~200 μL/dosis) kort før undersøgelsen og håndbære dem til hvert undersøgelsessted.

Syntese af 3,4-didehydroretinylacetat til gennemførelse af mål 4: Dr. Tanumihardjo syntetiserer rutinemæssigt 3,4-didehydroretinylacetat til Centers for Disease Control, Atlanta, Georgia, til brug i deres befolkningsbaserede ernæringsevalueringer. Derfor forudser vi ikke et problem med at bruge nuværende roterende bestande, der opbevares ved -80oC til den foreslåede vitamin A-statusevaluering hos spædbørn af de mødre, der er indskrevet i den kinetiske undersøgelse. De syntetiske procedurer, der udelukkende anvendes i Tanumihardjo-laboratoriet, er offentliggjort (Barua og Ghosh 1972; Tanumihardjo, Barua, Olson, 1987). Kort fortalt methyleres retinsyre med diazomethan. Det resulterende methylretinoat oxideres med mangandioxid til dannelse af 4=oxo-methylretinoat. Efter omhyggelig oprensning og krystallisation reduceres 4=oxo til 4-OH-methylretinoat under anvendelse af natriumborhydrid. Efter krystallisation i hexaner ved -30°C i flere dage dehydreres 4-OH med p-toluensulfonsyre, og det resulterende 3,4-didehydromethylretinoat oprenses og får lov at krystallisere natten over. Til sidst reduceres 3,4-didehydro-methylretinoat til 3,4-didehydroretinol med lithiumaluminiumhydrid og acetyleres straks til 3,4-didehydroretinylacetat, renses, opløses i sojabønneolie og opbevares ved -80oC, indtil doser er klargjort og tilpasset. til individuelle studier.

III.6. Etisk godkendelse Protokollerne og informerede samtykkeformularer vil gennemgå etisk gennemgang i IRSS's institutionelle vurderingsudvalg og vil blive registreret hos Pan African Clinical Trial Registry (www.pactr.org) database under et unikt identifikationsnummer. Vi har allerede erfaring med at arbejde med RID-testen hos børn (Bationo et al., 2019).

IV. Arbejdsplan for undersøgelse Tidsplan, IRSS Burkina Faso Aktiviteter År 1 år 2 år 3 år 4 Q1 Q2 Q3 Q4 Q1 Q2 Q3 Q4 Q1 Q2 Q3 Q4 Q1 Q2 Q3 Q3 Q4 Protokol færdiggørelse Etisk gennemgang og godkendelse Udvikling af SOP'er Forberedelse af undersøgelsessted Udvælgelse og uddannelse af undersøgelsespersonale Første runde af den første tværsnitsundersøgelse Prøveforberedelse og opbevaring Anden runde af den første tværsnitsundersøgelse undersøgelse Prøveforberedelse og -opbevaring Prøveforsendelse Første runde af den anden tværsnitsundersøgelse Prøveforberedelse og opbevaring Anden runde af den anden tværsnitsundersøgelse Prøveforberedelse og -opbevaring Prøveforsendelse Laboratorieanalyseret Datahåndtering Formidling, lokal, national, international