Validierung und Vereinfachung der Retinol-Isotopenverdünnungstechnik bei burkinischen Schulkindern (RID_VAB)

Projekttitel Validierung und Vereinfachung der Retinol-Isotopenverdünnungstechnik bei burkinischen Schulkindern

I. Hintergrund und rationale Biomarker für den Vitamin-A-Status, die den Goldstandard, d. h. Leberbiopsie, widerspiegeln, sind verfügbar, werden jedoch verfeinert, um die Zugänglichkeit für bevölkerungsbasierte Anwendungen zu verbessern. Der Retinol-Isotopenverdünnungstest (RID) ist ein solcher Biomarker. In Burkina Faso konnten wir einen 7-Tage-Test mit einem 14-Tage-Test auswerten, indem wir einfach einen Korrekturfaktor zur Vorhersagegleichung hinzufügten. Die Werte für die gesamten Vitamin-A-Speicher im Körper waren ähnlich, die Variation nahm jedoch mit zunehmenden Leberreserven zu. Die Annahme von 3 % des Körpergewichts als Lebergewicht bei Schulkindern wurde bei der Berechnung der gesamten Vitamin-A-Reserven der Leber als angemessen bestätigt. Die Vereinfachung der Isotopenverdünnung zur Bevölkerungsbewertung und der Aufbau von Kapazitäten für massenspektrometrische Analysen sind wichtige Bereiche der Ernährungsentwicklung zur Information öffentlicher Gesundheitsprogramme. Dieser Vorschlag wird die Methode für eine breite Anwendung weiter verfeinern.

II. Das übergeordnete Ziel: Bereitstellung neuer Erkenntnisse darüber, wie die Retinol-Isotopenverdünnungstechnik in größeren Bevölkerungsumfragen eingesetzt werden kann, um den Vitamin-A-Status vom Mangel bis zum Überschuss zu beurteilen.

II.1. Spezifische Ziele Für dieses CRP wurden mehrere spezifische Ziele dargelegt. Durch die Forschung, die in Burkina Faso durchgeführt wird, und anhand vorhandener Datensätze werden wir uns auf die folgenden spezifischen Ziele bei Schulkindern konzentrieren.

1. Bestimmung eines Vitamin-A-Überschusses an der gesamten Leberreserve durch Anwendung von Nüchtern-Serum-Retinylester-Daten bei Schulkindern mit RID-Test. 2. Untersuchung, wie die bestehende Methodik vereinfacht werden kann, um Bevölkerungsumfragen ohne Genauigkeitsverlust zu ermöglichen, indem Retinol-Reinigungstechniken vor Ort verwendet werden 3. Um zu untersuchen, wie die Technik der Retinol-Isotopenverdünnung durch Entzündungen zum Zeitpunkt der Dosierung beeinflusst wird, wird ein bestehender Datensatz bei afrikanischen Vorschulkindern verwendet. 4. Um den Unterschied in der Absorption von zu untersuchen 3,4-Didehydroretinylacetat aus Öl und in verkapselter Form bei Kindern im schulpflichtigen Alter.

III. Methode III.1. Studienort und Bevölkerung Die vorgeschlagene Studie wird in einer Grundschule im westlichen Teil von Burkina Faso in Orodara, einem Dorf am äußeren Rand von Bobo Dioulasso, durchgeführt, wo wir Kinder im Alter von 7 bis 12 Jahren ansprechen werden. Die meisten Einwohner des Dorfes sind Bauern mit mittlerem Einkommen und ihre Familien. Burkina Faso ist eines der am Konsortium VITAAFRO (Vitamin A in Africa) beteiligten Länder, das daran interessiert ist, den VA-Status genau zu bestimmen, um bestehende Interventionen und Richtlinien zu informieren.

III.2. Studiendesign Während eines Schuljahres werden zwei aufeinanderfolgende Querschnittsstudien durchgeführt. Die erste Studie zu Beginn des Schuljahres, das zufällig am Ende der Regenzeit und auch außerhalb der Mangosaison liegt, und die zweite Studie, 5 bis 6 Monate später, nach der ersten Datenerfassung, Während der Mangosaison werden diese Studien in einer Grundschule im westlichen Teil von Burkina Faso in Orodara, einem Dorf am äußeren Rand von Bobo Dioulasso, durchgeführt.

III.3. Stichprobenmethode Insgesamt werden 158 Schulkinder auf zwei verschiedene Arten rekrutiert. Zunächst wird eine Gruppe von 60 Schulkindern durch eine geschichtete Stichprobe rekrutiert, die Kinder vom ersten bis zum letzten Grundschuljahr umfasst und proportional zu ihrer Anzahl pro Klasse. Bei dieser ersten Gruppe von 60 Schulkindern wird ein Retinol-Isotopenverdünnungstest (RID) zur Beurteilung des Gesamtkörperspeichers angewendet, um die Werte mit den Retinylesterkonzentrationen im Nüchtern-Serum zu Studienbeginn zu vergleichen.

Die verbleibenden 98 Schulkinder werden nach einer geschichteten Stichprobe und proportional zu ihrer Anzahl pro Klasse rekrutiert und entsprechend dem Geschlecht (d. h. 49 Frauen und 49 Männer). Bei jedem Teilnehmer werden zwei Zeitpunkte der Blutentnahme durchgeführt. Dem Teilnehmer wird dann nach dem Zufallsprinzip eine Blutentnahme bei H0, H2, H3, H4, H5 H6 H8, H10, H24, H72, H168 und H336 zugeteilt, wie unten angegeben. Mithilfe von Zufallszahlentabellen wird eine Randomisierungsliste erstellt. Wir haben uns für eine Block-Randomisierung statt für eine einfache Randomisierung entschieden, da der erstere Ansatz es uns ermöglicht, unvoreingenommene Vergleichsgruppen zu haben, die während der gesamten Studie ungefähr die gleiche Größe haben. Durch die Block-Randomisierung wird es in jeder Studiengruppe immer eine annähernd gleiche Anzahl von Kindern geben.

Bei diesen Kindergruppen wird der modifizierte relative Dosis-Wirkungs-Test (MRDR), ein qualitatives Maß für den Vitamin-A-Status, verwendet, um die Absorption von 3,4-Didehydroretinylacetat zu untersuchen.

H0 (5), H2 (5), H3 (5), H4 (11), H5 (11) H6 (11) H8 (10), H10 (10), H24 (5), H72 (5), H168 ( 10), H336 (10)

III.4. Sensibilisierung und Sensibilisierung der Gemeinschaft Vor Beginn der Studie werden wir eine Reihe von Treffen mit wichtigen Entscheidungsträgern und Gemeindeführern im Untersuchungsgebiet durchführen, um das Bewusstsein zu schärfen und die Gemeinde für die Studie zu mobilisieren. Diese Community-Outreach- und Sensibilisierungstreffen werden die Community über die Existenz und den Zweck der Studie sowie die Vorteile nicht nur für ihre Communities, sondern auch für das Land und Afrika insgesamt informieren. Ihnen werden die Gründe für die Wahl des Bereichs für jedes Humanstudium und das vorgeschlagene Design erläutert.

III.5. Rekrutierung und Screening

Im Rahmen des Screening-Verfahrens wird eine Liste der teilnahmeberechtigten Schülerinnen und Schüler erstellt, aus der die Auswahl erfolgt. Kinder sind zur Teilnahme berechtigt, wenn sie die folgenden Screening-Kriterien erfüllen:

III.5.1. Einschlusskriterien:

• Schulkinder im Alter von 7-12 Jahren
• Der Erziehungsberechtigte oder Elternteil des Kindes ist bereit, eine Einverständniserklärung abzugeben
• Die Familie des Kindes plant, während des Studienzeitraums in den Studiengebieten zu bleiben

III.5.2. Ausschlusskriterien:

• Klinischer Nachweis eines Vitamin-A-Mangels.
• Schwere Unterernährung (Gewicht-für-Alter-Z-Score (WAZ) oder Körpergröße-für-Alter-Z-Score (HAZ) <-3 SD)
• Schwerwiegende Krankheiten, einschließlich Tuberkulose, symptomatische HIV-Infektion
• Kind im Alter von <6 Jahren oder >12 Jahren III.6. Studienvariablen Nach dem Screening auf Eignung wird die Einverständniserklärung des Kindes und seiner Betreuungsperson oder seines Elternteils eingeholt. Wir werden sozioökonomische Informationen sammeln (z. B. Einkommen, Bildung, Familienvermögen) und führen anthropometrische Messungen (Gewicht, Größe) durch, beurteilen den Hämoglobinstatus und bereiten dicke und dünne Blutausstriche zur Malariaerkennung vor. Zur Bestimmung von Darmparasiten wird eine Stuhlprobe entnommen.

III.7. Verarbeitung von Blutproben Für die 60 Kinder, die an der Analyse des gesamten Körperspeichers beteiligt sind, zielen wir auf Kinder im Alter von 7 bis 12 Jahren ab und es werden grundlegende Probandenmerkmale ermittelt. Zu Beginn wird jedem Kind eine nüchterne venöse Blutprobe (7 ml) entnommen. Anschließend erhalten sie eine orale Dosis von 1,0 μmol [14,15]-13C2-Retinylacetat, das wie veröffentlicht synthetisiert wird (Tanumihardjo, 2001), in Sojaöl gelöst und mit einer 250-Mikroliter-Pipette mit positiver Verdrängung verabreicht wird. Der Dosis folgt unmittelbar ein Teelöffel Olivenöl, um die Absorption zu unterstützen. Die Kinder erhalten ein standardisiertes Frühstück aus Weißbrot und Haselnusspaste mit Schokoladengeschmack. Das Folgeblut wird am 14. Tag nach der Dosis von den Krankenschwestern der Orodara-Klinik gesammelt, sofort auf Eis gelagert und zur Verarbeitung zum Institut de Recherche en Sciences de la Santé in Bobo-Dioulasso transportiert.

Die Serumproben derselben Gruppe von 60 Schulkindern werden in drei Röhrchen aufgeteilt und bei -80 °C eingefroren.

Alle Proben werden zur Analyse mittels Gaschromatographie-Verbrennungs-Isotopenverhältnis-Massenspektrometrie (GCCIRMS) wie unten beschrieben an die University of Wisconsin-Madison (UW) geschickt oder persönlich transportiert.

Die Basisblutproben werden auch auf Serum-Retinylester und Carotinoide analysiert, wie unten für geringe Probenvolumina beschrieben.

Eine ähnliche Methode wurde in der Vergangenheit in Burkina Faso angewendet (Bationo et al., 2018), wobei eine geringe Gemüseaufnahme festgestellt wurde. Allerdings ist mit Vitamin A angereichertes Öl seit der Durchführung dieser Studie im Land mittlerweile weit verbreitet. Diese Studie wird zur Validierung von Serum-Retinylestern als Maß für den Vitamin-A-Überschuss beitragen.

Eine Vorreinigung von Retinol aus Serum wird mithilfe von Festphasenextraktionsmethoden (SPE) mit Konservierungsmittel aus einem Aliquot untersucht, um die zusätzliche regulatorische Belastung durch den Versand menschlicher biologischer Proben (Serum) zu vermeiden. Wir werden zunächst optimale Protokolle an der University of Wisconsin – Madison ermitteln. Pilotstudien haben gezeigt, dass die Vorwärtsphasen-SPE mit NH2-Säulen und Hexan/Ethylacetat-Lösungsmitteln eine sehr hohe Rückgewinnung und Reinheit von Retinol aus Serum aufweist, und wir werden butyliertes Hydroxytoluol und Alpha-Tocopherol als Konservierungsmittel untersuchen. Wenn vor Ort eine SPE-Vorreinigung eingesetzt wird, würden wir planen, das Retinol vor der Einführung in GCCIRMS erneut durch HPLC zu reinigen, damit wir bestimmen, welches Konservierungsmittel die HPLC-Nachreinigung und -Analyse nicht beeinträchtigt.

Ein bestehender Datensatz bei afrikanischen Vorschulkindern im Alter von 3 bis 4 Jahren, um zu untersuchen, wie die RID-Technik zum Zeitpunkt der Dosierung durch Entzündungen beeinflusst wird. Es ist bekannt, dass Serum-Retinol und Retinol-bindendes Protein durch Entzündungen vorübergehend verringert werden (Filteau et al., 1993; Thurnham et al., 2003). Dies kann Schätzungen des Vitamin-A-Status in Populationen mit einem hohen Maß an klinischen oder subklinischen Infektionen beeinflussen (Suri et al., 2015; 2021). Allerdings wurde die mögliche Auswirkung einer Entzündung auf den RID bei einer großen Gruppe von Kindern nicht untersucht. Wir haben die gesamten Vitamin-A-Speicher im Körper von Kindern aus Burkina Faso, Äthiopien, Kamerun, Südafrika und Tansania berechnet. Der Entzündungsstatus wurde durch Messung des C-reaktiven Proteins (CRP) und des sauren Alpha1-Glykoproteins (AGP) beurteilt, die aus Blutproben zum Zeitpunkt der Dosierung entnommen wurden. Wir werden den Zusammenhang zwischen den Gesamtleberreserven (TLR) basierend auf dem 13C-RID-Test und den kontinuierlichen Werten von CRP und AGP untersuchen und testen, ob die Steigung der Beziehung ungleich Null ist. Wir werden auch die kategorialen Mittelwerte für TLR anhand der folgenden vier Entzündungskategorien vergleichen: keine Entzündung, Inkubation (nur erhöhtes CRP (>5 mg/l), frühe Rekonvaleszenz (erhöhtes CRP und AGP (>1 g/l)) und späte Rekonvaleszenz (nur erhöhtes AGP) unter Verwendung eines ANOVA-Tests für Unterschiede zwischen Gruppen.

Für die zweite Querschnittsstudie mit MRDR-Test zielen wir weiterhin auf Kinder im Alter von 7 bis 12 Jahren ab und es werden Ausgangscharakteristika der Probanden ermittelt, um die Absorptionskurven mithilfe eines Analogons auszuwerten und festzustellen, ob es mithilfe von Kapseln einen Unterschied in den Absorptionskurven gibt.

In dieser Studie wird die Absorption von 3,4-Didehydroretinylacetat als Analogie zu markiertem Retinylacetat in Kapseln im Vergleich zu direkten oralen Dosen in Öl untersucht. Unter Verwendung der gleichen Sensibilisierungs- und Sensibilisierungsverfahren wie oben erwähnt werden die Kinder in sechs Gruppen zu je 15 Personen eingeteilt und nach dem Zufallsprinzip einer Kapselverabreichung oder einer direkten oralen Dosis mit unterschiedlichen Zeitpunkten der Blutentnahme von 0 bis 7 Stunden später zugewiesen. Alle Proben werden auf 3,4-Didehydroretinol und 3,4-Didehydroretinylester analysiert. Die Alkoholform entspricht derjenigen, die an das Retinol-bindende Protein (RBP) gebunden ist, während die Ester die Absorptionskurven widerspiegeln.

Alle Kinder erhalten 7,0 μmol 3,4-Didehydroretinylacetat, gelöst in etwa 200 μl Sojaöl. Der Grenzwert für einen Vitamin-A-Mangel für den MRDR-Test liegt bei 0,060, was dem Verhältnis von 3,4-Didehydroretinol zu Retinol 4 bis 6 Stunden nach der Dosierung entspricht. Daher wird jedes Kind diese Messung durchführen lassen. Die Fläche unter der Esterabsorptionskurve nach 2 bis 5 Stunden zeigt die Chylomikronenverteilung der oralen Dosis. Alle Proben werden mit der standardmäßigen 250-μL-Methode für die MRDR und einer erweiterten UPLC-Methode für 3,4-Didehydroretinol und 3,4-Didehydroretinylester analysiert.

Die Studie wird zwei Phasen haben:

Eine erste Phase wird nach der Mangosaison (November-Dezember) und eine zweite Phase der Studie während der Mangosaison (April-Mai) durchgeführt.

III.8. Laboranalyse

Analyse von Proben mittels Gaschromatographie-Verbrennungs-Isotopenverhältnis-Massenspektrometrie (GCCIRMS):

Serum: Über Serumextraktionsverfahren und Instrumente für die GCCIRMS-Analyse wurde bereits berichtet (Howe et al., 2009; Gannon et al., 2014). Kurz gesagt, das Serum wurde bei Raumtemperatur aufgetaut. Zu 0,75 ml (oder allem verfügbaren) Serum wird Ethanol (1 x Vol) hinzugefügt, um Proteine ​​auszufällen, C23-Beta-Apo-Carotinol wird als interner Standard hinzugefügt und es werden 3 x 1 ml Hexan-Extraktionen durchgeführt. Hexane werden gepoolt, unter Stickstoff getrocknet, in 100 μl Methanol resuspendiert, etwa 5 Minuten lang bei -80 °C eingefroren, kurz zentrifugiert und zur Quantifizierung und Reinigung in das HPLC-System 1 injiziert. System 1 ist eine Gracesmart C18-Säule (5 μm, 4,6 x 250 mm) mit 92:8 Acetonitril:Wasser bei 1,0 ml/min. Die Retinolfraktion wurde gesammelt, unter Stickstoff getrocknet und zur Injektion in System 2 in 100 μl Methanol resuspendiert. System 2 ist eine identische Säule mit 100 % Methanol bei 0,7 ml/min. Die Retinol-Fraktion wird gesammelt, unter Vakuum mit einem SPD1010 SpeedVac getrocknet, in 4–6 μL Hexan resuspendiert und 1–3 μL in den GC injiziert (um etwa 75 ng zu injizieren). Das GC/C/IRMS-System wurde veröffentlicht (Howe et al., 2009). Atom % (At%) wird direkt in Bezug auf Kohlendioxid berechnet (Isodat Version 2.0), das gegen einen Saccharosestandard (NIST, 8542) kalibriert ist.

Retinylester- und Carotinoid-Analyse: Serumcarotinoide und Retinylester werden wie veröffentlicht (Williams et al., 2021) im Labor der University of Wisconsin-Madison Department of Nutritional Sciences mittels Ultra-Performance-Flüssigkeitschromatographie (Waters UPLC®) gemäß a analysiert zuvor beschriebenes Lösungsmittelsystem (Gannon et al., 2018), optimiert für geringe Probenvolumina und gewünschte Analyten. Kurz gesagt, 150 μL Serum oder alles verfügbare Serum werden in Borosilikatglasröhrchen (Fisher Scientific) aliquotiert, denen 100 μL C-23-β-Apo-Carotinol (interne optische Standarddichte in Methanol ~1,0 bei 325 nm) und 225 μL Ethanol zugesetzt werden hinzugefügt. Organische Verbindungen werden dreimal mit 500 μl Hexanen extrahiert, mit einem Vortex gemischt und bei einer relativen Zentrifugalkraft von 1200 Schwerkrafteinheiten 5 Minuten lang zentrifugiert. Gepoolte Hexanschichten werden in Glasröhrchen mit konischem Boden unter einem Stickstoffstrom getrocknet. Der getrocknete Extrakt wird in 75 μl einer Methanol:Dichlorethan-Konzentration von 75:25 resuspendiert, in UPLC-Fläschchen (Waters) überführt und 6 μl in das UPLC-System injiziert.

III.9. Organische Synthese zum Abschluss des Projekts. Synthese von 13C-Retinylacetat zur Verwirklichung der Ziele 1 und 2. 13C2-Retinylacetat wird nach einem Verfahren synthetisiert, das ausführlich von Tanumihardjo (2001) veröffentlicht wurde. Kurz gesagt, C18-Tetraenketon wird aus β-Ionon, einem kommerziell erhältlichen Vorläufer, synthetisiert und sorgfältig gereinigt. Unter Verwendung eines modifizierten Whittig-Horner-Verfahrens wird C-18-Tetraenketon mit dem Carbanion von 13C2-markiertem Triethylphosponoacetat umgesetzt, um 2-13Cs an das Rückgrat der Retinol-Einheit hinzuzufügen. Der resultierende Ethylester wird zum Alkohol reduziert und mit Essigsäureanhydrid zu 13C2-Retinylacetat verestert. Das synthetische all-trans-Isomer wird sorgfältig auf mit 8 % Wasser desaktiviertem Aluminiumoxid unter Verwendung relativ harmloser, leicht flüchtiger organischer Lösungsmittel, z. B. Hexane und Diethylether, gereinigt. Das resultierende Präparat wird mittels UV-VIS-Spektroskopie, TLC und HPLC charakterisiert. Zur Langzeitlagerung wird das 14,15-13C2-Retinylacetat gelöst in Sojaöl bei -80 °C gelagert. Wir bereiten die endgültigen Dosen in Sojaöl (~200 μl/Dosis) kurz vor der Studie vor und tragen sie per Hand zu jedem Studienort.

Synthese von 3,4-Didehydroretinylacetat zur Verwirklichung von Ziel 4: Dr. Tanumihardjo synthetisiert routinemäßig 3,4-Didehydroretinylacetat für die Centers for Disease Control, Atlanta, Georgia, zur Verwendung in deren bevölkerungsbezogenen Ernährungsbewertungen. Daher sehen wir kein Problem bei der Verwendung aktueller rotierender Bestände, die bei -80 °C gelagert werden, für die vorgeschlagene Bewertung des Vitamin-A-Status bei den Säuglingen der Mütter, die an der kinetischen Studie teilnehmen. Die ausschließlich im Tanumihardjo-Labor verwendeten Syntheseverfahren werden veröffentlicht (Barua und Ghosh 1972; Tanumihardjo, Barua, Olson, 1987). Kurz gesagt, Retinsäure wird mit Diazomethan methyliert. Das resultierende Methylretinoat wird mit Mangandioxid oxidiert, um 4=Oxo-Methylretinoat zu bilden. Nach sorgfältiger Reinigung und Kristallisation wird das 4=Oxo mit Natriumborhydrid zu 4-OH-Methylretinoat reduziert. Nach mehrtägiger Kristallisation in Hexan bei -30 °C wird 4-OH mit p-Toluolsulfonsäure dehydratisiert und das resultierende 3,4-Didehydromethylretinoat gereinigt und über Nacht kristallisieren gelassen. Schließlich wird 3,4-Didehydromethylretinoat mit Lithiumaluminiumhydrid zu 3,4-Didehydroretinol reduziert und sofort zu 3,4-Didehydroretinylacetat acetyliert, gereinigt, in Sojaöl gelöst und bei -80 °C gelagert, bis die Dosen zubereitet und angepasst werden für Einzelstudien.

III.6. Ethische Freigabe Die Protokolle und Einverständniserklärungen werden einer ethischen Prüfung durch die Institutional Review Boards des IRSS unterzogen und im Pan African Clinical Trial Registry (www.pactr.org) registriert. Datenbank unter einer eindeutigen Identifikationsnummer. Wir haben bereits Erfahrungen mit dem RID-Test bei Kindern (Bationo et al., 2019).

IV. Studienarbeitsplan Zeitplan, IRSS Burkina Faso Aktivitäten Jahr 1 Jahr 2 Jahr 3 Jahr 4 Q1 Q2 Q3 Q4 Q1 Q2 Q3 Q4 Q1 Q2 Q3 Q4 Q1 Q2 Q3 Q4 Abschluss des Protokolls Ethische Überprüfung und Genehmigung SOP-Entwicklung Vorbereitung des Studienstandorts Auswahl und Schulung des Studienpersonals Erste Runde der ersten Querschnittsstudie Probenvorbereitung und -lagerung Zweite Runde der ersten Querschnittsstudie Probenvorbereitung und -lagerung Probenversand Erste Runde der zweiten Querschnittsstudie Probenvorbereitung und -lagerung Zweite Runde der zweiten Querschnittsstudie Probenvorbereitung und -lagerung Probenversand Laboranalyse Datenverarbeitung Verbreitungen, lokal, national, international