Ověření a zjednodušení techniky ředění izotopů retinolu u školáků z Burkinabe (RID_VAB)

Název projektu Validace a zjednodušení techniky ředění izotopů retinolu u školáků z Burkinabe

I. Pozadí a racionální Biomarkery stavu vitaminu A, které odrážejí zlatý standard, tj. jaterní biopsie, jsou dostupné, ale procházejí zdokonalováním, aby se zvýšila dostupnost v populačních aplikacích. Jedním z takových biomarkerů je testování izotopového ředění retinolu (RID). V Burkině Faso jsme byli schopni vyhodnotit 7denní test 14denním testem s jednoduchým přidáním korekčního faktoru do predikční rovnice. Hodnoty pro celkové tělesné zásoby vitaminu A byly podobné, ale variace se zvyšovala se zvyšujícími se jaterními rezervami. Předpoklad 3 % tělesné hmotnosti jako hmotnosti jater u dětí školního věku byl potvrzen jako vhodný při výpočtu celkových jaterních rezerv vitaminu A. Zjednodušení ředění izotopů pro hodnocení populace a budování kapacity pro analýzy hmotnostní spektrometrií jsou důležitými oblastmi rozvoje výživy pro informování programů veřejného zdraví. Tento návrh bude i nadále zdokonalovat metodu pro široké použití.

II. Celkový cíl Poskytnout nové poznatky o tom, jak používat techniku ​​ředění izotopů retinolu v průzkumech větší populace k posouzení stavu vitaminu A od nedostatku po nadbytek.

II.1. Specifické cíle Pro toto CRP bylo nastíněno několik specifických cílů. Prostřednictvím výzkumu, který bude proveden v Burkině Faso, a na existujících souborech dat se zaměříme na následující specifické cíle u školáků.

1. Definovat přebytek celkové jaterní rezervy nadbytkem vitaminu A aplikací údajů o sérovém retinylesteru nalačno u školáků pomocí testu RID 2. Prozkoumat, jak lze stávající metodologii zjednodušit tak, aby vyhovovala populačním průzkumům bez ztráty přesnosti, pomocí technik čištění retinolu na místě 3. Prozkoumat, jak je technika ředění izotopů retinolu ovlivněna zánětem v době dávkování pomocí existujícího souboru dat u afrických předškolních dětí. 4. Zkoumat rozdíl v absorpci 3,4-didehydroretinylacetát z oleje a v zapouzdřené formě u dětí školního věku.

III. Metoda III.1. Místo studie a populace Navrhovaná studie bude provedena na základní škole v západní části Burkiny Faso, v Orodara, vesnici na vnějším okraji Bobo Dioulasso, kde se zaměříme na děti ve věku 7 až 12 let. Většina obyvatel obce jsou středně příjmovými zemědělci a jejich rodinami. Burkina Faso je jednou ze zemí zapojených do konsorcia VITAAFRO (vitamín A v Africe), které má zájem na přesném určování statusu VA pro informování o stávajících intervencích a politikách.

III.2. Návrh studie V průběhu školního roku budou realizovány dvě navazující průřezové studie. První studie na začátku školního roku, což je shodou okolností na konci období dešťů a které je také mimo sezónu manga, a druhá studie, o 5 až 6 měsíců později, po prvním souboru sběru dat, během sezóny manga budou tyto studie prováděny na základní škole v západní části Burkiny Faso, ve vesnici Orodara na vnějším okraji Bobo Dioulasso.

III.3. Metoda výběru Celkem 158 školních dětí bude přijato dvěma různými způsoby. Nejprve bude skupina 60 školních dětí přijata prostřednictvím stratifikovaného vzorku zahrnujícího děti od prvního do posledního roku základní školy a úměrně jejich počtu ve třídě. U této první skupiny 60 školních dětí bude použit test ředění izotopů retinolu (RID) pro hodnocení celkové tělesné zásoby, aby se porovnaly hodnoty s výchozími koncentracemi retinylesteru v séru nalačno.

Zbývajících 98 školních dětí bude rekrutováno podle stratifikovaného výběru a úměrně jejich počtu ve třídě a rozděleno do dvou skupin po 49 dětech podle pohlaví (tj. 49 žen a 49 mužů). U každého účastníka budou provedeny dva časové body odběru krve. Účastník bude poté náhodně přidělen k odběru krve v H0, H2, H3, H4, H5 H6 H8, H10, H24, H72, H168 a H336, jak je uvedeno níže. Randomizační seznam bude generován pomocí tabulek náhodných čísel. Rozhodli jsme se provést blokovou spíše než jednoduchou randomizaci, protože první přístup nám umožní mít nezaujaté srovnávací skupiny, které budou v průběhu studie zhruba stejně velké. Při použití blokové randomizace bude v každé studijní skupině vždy téměř stejný počet dětí.

U těchto skupin dětí bude ke zkoumání absorpce 3,4-didehydroretinylacetátu použit test modifikované relativní odpovědi na dávku (MRDR), kvalitativní měření stavu vitaminu A.

H0 (5), H2 (5), H3 (5), H4 (11), H5 (11) H6 (11) H8 (10), H10 (10), H24 (5), H72 (5), H168 ( 10), H336 (10)

III.4. Povědomí a senzibilizace komunity Před zahájením studie uspořádáme řadu setkání s klíčovými činiteli s rozhodovací pravomocí a vůdci komunity ve zkoumané oblasti jako součást úsilí o zvýšení povědomí a mobilizaci komunity pro studii. Tato komunitní setkání a senzibilizační setkání budou informovat komunitu o existenci a účelu studie, stejně jako o přínosech nejen pro jejich komunity, ale také pro zemi a Afriku jako celek. Budou jim vysvětleny důvody pro výběr oblasti pro každou z lidských studií a navržený design.

III.5. Nábor a prověřování

V rámci screeningového procesu bude vytvořen seznam oprávněných školáků, ze kterého bude proveden výběr. Děti se budou moci zúčastnit, pokud splní následující kritéria:

III.5.1. Kritéria zařazení:

• Školní děti ve věku 7-12 let
• Opatrovník nebo rodič dítěte je ochoten poskytnout informovaný souhlas
• Rodina dítěte plánuje zůstat ve studovaných oblastech během studijního období

III.5.2. Kritéria vyloučení:

• Klinické důkazy nedostatku vitaminu A ve formě: Anglais (Royaume-Uni)a ve formě: Anglais (États-Unis)a ve formě: Anglais (États-Unis)a ve formě: Anglais (États-Unis)
• Těžká podvýživa (skóre Z hmotnosti pro věk (WAZ) nebo Z skóre pro výšku a věk (HAZ) <-3 SD)
• Závažná onemocnění včetně tuberkulózy, symptomatická infekce HIV
• Dítě ve věku <6 let nebo >12 let III.6. Proměnné studie Po screeningu způsobilosti bude získán informovaný souhlas od dítěte a jeho pečovatele nebo rodiče. Budeme shromažďovat socioekonomické informace (např. příjem, vzdělání, rodinný majetek) a provádět antropometrická měření (hmotnost, výška), posouzení stavu hemoglobinu a připravit tlusté a tenké krevní nátěry pro detekci malárie. Pro stanovení střevních parazitů bude odebrán vzorek stolice.

III.7. Zpracování krevních vzorků U 60 dětí zapojených do analýzy celkové tělesné zásoby se zaměříme na děti ve věku 7 až 12 let a získají se základní charakteristiky subjektu. Na začátku bude každému dítěti odebrán vzorek žilní krve nalačno (7 ml). Poté jim bude podána perorální dávka 1,0 μmol [14,15]-13C2-retinyl acetátu, který bude syntetizován tak, jak bylo publikováno (Tanumihardjo, 2001), rozpuštěn v sójovém oleji a podán 250 mikrol pozitivní vytěsňovací pipetou. Po dávce bude ihned následovat jedna čajová lžička olivového oleje pro podporu vstřebávání. Děti budou jíst standardizovanou snídani z bílého chleba a lískooříškové pasty s čokoládovou příchutí. Následná krev bude odebrána zdravotními sestrami Orodara's klinika 14. den po podání dávky, okamžitě uložena na ledu a dopravena do Institutu de Recherche en Sciences de la Santé se sídlem v Bobo-Dioulasso ke zpracování.

Vzorky séra stejné skupiny 60 školních dětí budou rozděleny do tří zkumavek a zmraženy na -80 °C.

Všechny vzorky budou odeslány nebo ručně přeneseny na University of Wisconsin-Madison (UW) k analýze pomocí hmotnostní spektrometrie s poměrem plynové chromatografie-spalovací-izotop (GCCIRMS), jak je uvedeno níže.

Základní krevní vzorky budou také analyzovány na sérové ​​retinylestery a karotenoidy, jak je popsáno níže pro nízké objemy vzorků.

Podobná metoda byla v minulosti použita v Burkině Faso (Bationo et al., 2018), která odhalila nízký příjem zeleniny. Od doby, kdy byla provedena tato studie, se však olej obohacený vitamínem A stal v zemi široce dostupný. Tato studie bude přidanou hodnotou k validaci sérových retinylesterů jako měřítka nadbytku vitaminu A.

Předčištění retinolu ze séra bude zkoumáno pomocí metod extrakce na pevné fázi (SPE) s konzervační látkou z jednoho alikvotu, aby se předešlo mimořádné regulační zátěži přepravy lidských biologických vzorků (séra). Nejprve určíme optimální protokoly na University of Wisconsin – Madison. Pilotní studie naznačily, že SPE v dopředné fázi využívající NH2 kolony a hexan/ethylacetátová rozpouštědla mají velmi vysokou výtěžnost a čistotu retinolu ze séra, a budeme zkoumat butylovaný hydroxytoluen a alfa-tokoferol jako konzervační látky. Pokud se v terénu použije předčištění SPE, plánovali bychom přečištění retinolu pomocí HPLC před zavedením do GCCIRMS, takže určíme, které konzervační činidlo nebude interferovat s přečištěním a analýzou HPLC.

Existující soubor dat u afrických předškolních dětí ve věku 3 až 4 let, aby se prozkoumalo, jak je technika RID ovlivněna zánětem v době dávkování. Je dobře známo, že sérový retinol a retinol vázající protein jsou dočasně sníženy zánětem (Filteau et al., 1993; Thurnham et al., 2003). To může ovlivnit odhady stavu vitaminu A v populacích s vysokou úrovní klinických nebo subklinických infekcí (Suri et al., 2015; 2021). Potenciální účinek zánětu na RID však nebyl u velké skupiny dětí hodnocen. Vypočítali jsme celkové tělesné zásoby vitamínu A u dětí z Burkiny Faso, Etiopie, Kamerunu, Jižní Afriky a Tanzanie. Stav zánětu byl hodnocen měřením C-reaktivního proteinu (CRP) a alfa1-kyselého glykoproteinu (AGP) získaných ze vzorků krve v době dávkování. Podíváme se na souvislost mezi celkovými jaterními rezervami (TLR) na základě 13C-RID testu a kontinuálními hodnotami CRP a AGP, testujeme, zda sklon vztahu není roven nule. Porovnáme také kategorické průměry pro TLR pomocí následujících čtyř kategorií zánětu: žádný zánět, inkubace (pouze zvýšené CRP (>5 mg/l)), časná rekonvalescence (zvýšené CRP a AGP (>1 g/l)) a pozdní rekonvalescence (pouze zvýšené AGP) pomocí testu ANOVA pro rozdíly mezi skupinami.

Pro druhou průřezovou studii zahrnující test MRDR se stále zaměříme na děti ve věku 7 až 12 let a základní charakteristiky subjektu budou získány pro vyhodnocení křivek absorpce pomocí analogu a pro určení, zda existuje rozdíl v absorpčních křivkách pomocí kapslí.

Tato studie bude zkoumat absorpci 3,4-didehydroretinylacetátu jako analogie značeného retinylacetátu v kapslích oproti přímým orálním dávkám v oleji. Za použití stejných postupů uvědomění a senzibilizace, jak je uvedeno výše, budou děti rozděleny do šesti skupin po 15 a náhodně přiděleny k podávání kapslí nebo přímé perorální dávce s různým časovým bodem odběru krevních vzorků, od 0 do 7 hodin později. Všechny vzorky budou analyzovány na 3,4-didehydroretinol a 3,4-didehydroretinyl estery. Alkoholová forma se bude rovnat té, která je vázána na protein vázající retinol (RBP), zatímco estery budou odrážet absorpční křivky.

Všechny děti dostanou 7,0 μmol 3,4-didehydroretinylacetátu rozpuštěného v přibližně 200 μl sójového oleje. Hraniční hodnota pro nedostatek vitaminu A pro test MRDR je 0,060, což je poměr 3,4-didehydroretinolu k retinolu za 4 až 6 hodin po podání dávky. Toto měření tedy bude mít každé dítě. Oblast pod křivkou absorpce esteru od 2 do 5 hodin odhalí distribuci chylomikronů z perorální dávky. Všechny vzorky budou analyzovány standardní 250 μl metodou pro MRDR a rozšířenou metodou UPLC pro 3,4-didehydroretinol a 3,4-didehydroretinyl estery.

Studie bude mít dvě fáze:

Počáteční fáze bude provedena po sezóně manga (listopad–prosinec) a druhá fáze studie bude provedena během sezóny manga (duben–květen).

III.8. Laboratorní rozbor

Analýza vzorků plynovou chromatografií-spalovací-izotopová poměrová hmotnostní spektrometrie (GCCIRMS):

Sérum: Postupy extrakce séra a vybavení pro analýzu GCCIRMS byly popsány již dříve (Howe et al., 2009; Gannon et al., 2014). Stručně řečeno, sérum jsme rozmrazili při pokojové teplotě. K 0,75 ml (nebo všemu dostupnému) séru se přidá ethanol (1 x obj.) k vysrážení proteinů, přidá se C23 beta-apo-karotenol jako vnitřní standard a provedou se 3 x 1 ml extrakce hexanem. Hexany se spojí, vysuší pod dusíkem, resuspendují ve 100 ul methanolu, zmrazí na -80 °C po dobu ~5 minut, krátce odstředí a nastříknou do systému HPLC 1 pro kvantifikaci a čištění. Systém 1 je kolona Gracesmart C18 (5 um, 4,6 x 250 mm) s 92:8 acetonitril:voda při 1,0 ml/min. Retinolová frakce byla shromážděna, vysušena pod dusíkem a resuspendována ve 100 μl methanolu pro injekci do systému 2. Systém 2 je identická kolona se 100% methanolem při 0,7 ml/min. Frakce retinolu se shromáždí, suší se ve vakuu pomocí SPD1010 SpeedVac, resuspenduje se ve 4-6 μl hexanu a 1-3 μl se vstříkne (pro vstříknutí přibližně 75 ng) do GC. Byl publikován systém GC/C/IRMS (Howe et al., 2009). Atom % (At %) se přímo vypočítá (Isodat verze 2.0) s odkazem na oxid uhličitý, který je kalibrován proti standardu sacharózy (NIST, 8542).

Analýza retinylesterů a karotenoidů: Sérové ​​karotenoidy a retinylestery budou analyzovány tak, jak bylo publikováno (Williams et al., 2021) v laboratoři University of Wisconsin-Madison Department of Nutritional Sciences pomocí ultravýkonné kapalinové chromatografie (Waters UPLC®) podle dříve popsaný systém rozpouštědel (Gannon et al., 2018), optimalizovaný pro nízké objemy vzorků a požadovaný analyty. Stručně řečeno, 150 μl séra nebo všech dostupných sér se alikvotuje do zkumavek z borosilikátového skla (Fisher Scientific), do kterých je 100 μl C-23 β-apo-karotenolu (vnitřní standardní optická hustota v methanolu ~1,0 při 325 nm) a 225 μl ethanolu. přidáno. Organické sloučeniny se extrahují třikrát 500 μl hexanů, promíchají se na vortexu a odstředí se při relativní odstředivé síle 1200 jednotek gravitace po dobu 5 minut. Spojené hexanové vrstvy se suší ve skleněných zkumavkách s kónickým dnem pod proudem dusíku. Vysušený extrakt se resuspenduje v 75 ul směsi methanol:dichlorethan o koncentraci 75:25, přenese se do lahviček UPLC (Waters) a 6 ul se vstříkne do systému UPLC.

III.9. Organická syntéza pro dokončení projektu. Syntéza 13C-retinylacetátu pro dokončení cílů 1 a 2. 13C2-retinylacetát bude syntetizován pomocí postupu, který podrobně publikoval Tanumihardjo (2001). Stručně, C18-tetraenketon se syntetizuje z p-iononu, komerčně dostupného prekurzoru, a pečlivě se čistí. Za použití modifikovaného Whittig-Hornerova postupu se C-18 tetraenketon nechá reagovat s karbanionem 13C2-značeného triethylfosfonoacetátu, aby se přidaly 2-13C do hlavního řetězce retinolové skupiny. Výsledný ethylester se redukuje na alkohol a esterifikuje na 13C2-retinylacetát anhydridem kyseliny octové. Syntetický all-trans izomer se pečlivě čistí na alumině deaktivované 8% vodou za použití relativně neškodných, vysoce těkavých organických rozpouštědel, např. hexanů a diethyletheru. Výsledný přípravek je charakterizován pomocí UV-VIS spektroskopie, TLC a HPLC. Pro dlouhodobé skladování se 14,15-13C2-retinylacetát skladuje rozpuštěný v sójovém oleji při -80 °C. Finální dávky připravíme v sójovém oleji (~200 μL/dávka) krátce před studií a ručně je přeneseme na každé místo studie.

Syntéza 3,4-didehydroretinylacetátu pro dokončení Cíle 4: Dr. Tanumihardjo rutinně syntetizuje 3,4-didehydroretinylacetát pro Centers for Disease Control, Atlanta, Georgia, aby jej mohl použít při hodnocení výživy na základě populace. Proto nepředpokládáme problém při použití současných rotujících zásob, které jsou skladovány při -80 °C pro navrhované hodnocení stavu vitaminu A u kojenců matek zařazených do kinetické studie. Jsou publikovány syntetické postupy používané výhradně v laboratoři Tanumihardjo (Barua a Ghosh 1972; Tanumihardjo, Barua, Olson, 1987). Stručně, kyselina retinová je methylována diazometanem. Výsledný methylretinoát se oxiduje oxidem manganičitým za vzniku 4=oxomethylretinoátu. Po pečlivém čištění a krystalizaci se 4=oxo redukuje na 4-OH methylretinoát za použití borohydridu sodného. Po několika dnech krystalizace v hexanu při -30 °C se 4-OH dehydratuje kyselinou p-toluensulfonovou a výsledný 3,4-didehydromethylretinoát se přečistí a nechá se přes noc krystalizovat. Nakonec se 3,4-didehydro-methylretinoát redukuje na 3,4-didehydroretinol pomocí lithiumaluminiumhydridu a okamžitě acetyluje na 3,4-didehydroretinylacetát, čistí, rozpustí v sójovém oleji a skladuje při -80 °C, dokud nejsou připraveny a přizpůsobeny dávky. pro individuální studium.

III.6. Etické schválení Protokoly a formuláře informovaného souhlasu projdou etickou kontrolou v Institutional Review Boards IRSS a budou registrovány v Pan African Clinical Trial Registry (www.pactr.org). databáze pod jedinečným identifikačním číslem. Zkušenosti s prací s RID testem u dětí již máme (Bationo et al., 2019).

IV. Pracovní plán studie Časový plán, Aktivity IRSS Burkina Faso Rok 1 Rok 2 Rok 3 Rok 4 Q1 Q2 Q3 Q4 Q1 Q2 Q3 Q4 Q1 Q2 Q3 Q4 Q1 Q2 Q3 Q4 Dokončení protokolu Etická kontrola a schvalování Příprava SOP Příprava místa studia Výběr a školení studijních pracovníků První kolo první průřezové studie Příprava a skladování vzorků Druhé kolo první průřezové studie Příprava a skladování vzorků Zasílání vzorků První kolo druhé průřezové studie Příprava a skladování vzorků Druhé kolo druhé průřezové studie Příprava a skladování vzorků Zasílání vzorků Laboratorně analyzováno Zpracování dat Šíření, místní, národní, mezinárodní