Convalida e semplificazione della tecnica di diluizione dell'isotopo del retinolo negli scolari del Burkinabe (RID_VAB)

Titolo del progetto Validazione e semplificazione della tecnica di diluizione dell'isotopo del retinolo negli scolari burkinabesi

I. Biomarcatori di base e razionali dello stato della vitamina A che riflettono il gold standard, vale a dire la biopsia epatica, sono disponibili ma in fase di perfezionamento per aumentare l'accessibilità nelle applicazioni basate sulla popolazione. Il test della diluizione isotopica del retinolo (RID) è uno di questi biomarcatori. In Burkina Faso siamo stati in grado di valutare un test di 7 giorni con un test di 14 giorni con la semplice aggiunta di un fattore di correzione all'equazione di previsione. I valori delle riserve totali di vitamina A nel corpo erano simili, ma la variazione aumentava con l’aumento delle riserve epatiche. L'assunzione del 3% del peso corporeo come peso del fegato nei bambini in età scolare è stata confermata come appropriata nel calcolo delle riserve totali di vitamina A nel fegato. Semplificare la diluizione isotopica per la valutazione della popolazione e sviluppare capacità per le analisi di spettrometria di massa sono aree importanti dello sviluppo nutrizionale per informare i programmi di sanità pubblica. Questa proposta continuerà a perfezionare il metodo per un uso diffuso.

II. L'obiettivo generale Fornire nuove conoscenze su come utilizzare la tecnica di diluizione dell'isotopo del retinolo in indagini sulla popolazione più ampie per valutare lo stato della vitamina A dalla carenza all'eccesso.

II.1. Obiettivi specifici Per il presente CRP sono stati delineati diversi obiettivi specifici. Attraverso la ricerca che sarà condotta in Burkina Faso e sui set di dati esistenti, ci concentreremo sui seguenti obiettivi specifici negli scolari.

1. Definire un valore di riserva epatica totale in eccesso di vitamina A applicando i dati sugli esteri retinilici sierici a digiuno negli scolari con test RID 2. Esaminare come la metodologia esistente possa essere semplificata per adattarsi alle indagini sulla popolazione senza perdita di accuratezza, utilizzando tecniche di purificazione del retinolo in loco 3. Esplorare come la tecnica di diluizione isotopica del retinolo viene influenzata dall'infiammazione al momento del dosaggio utilizzando un set di dati esistente nei bambini africani in età prescolare 4. Esaminare la differenza nell'assorbimento di acetato di 3,4-dideidroretinile dal petrolio e in forma incapsulata nei bambini in età scolare.

III. Metodo III.1. Luogo di studio e popolazione Lo studio proposto sarà condotto in una scuola elementare nella parte occidentale del Burkina Faso, a Orodara, un villaggio al confine esterno di Bobo Dioulasso, dove ci rivolgeremo a bambini dai 7 ai 12 anni. La maggior parte degli abitanti del villaggio sono agricoltori a reddito medio e le loro famiglie. Il Burkina Faso è uno dei paesi coinvolti nel consorzio VITAAFRO (Vitamina A in Africa) interessato a determinare con precisione lo stato VA per informare gli interventi e le politiche esistenti.

III.2. Progetto dello studio Durante l'anno scolastico verranno svolti due studi trasversali successivi. Il primo studio all'inizio dell'anno scolastico, che coincide con la fine della stagione delle piogge, e che è anche al di fuori della stagione dei manghi e il secondo studio, 5 o 6 mesi dopo, dopo la prima serie di raccolta dati, durante la stagione del mango questi studi verranno condotti in una scuola elementare nella parte occidentale del Burkina Faso, a Orodara, un villaggio alla periferia di Bobo Dioulasso.

III.3. Metodo di campionamento In totale verranno reclutati 158 scolari in due modi diversi. In una prima fase verrà reclutato un gruppo di 60 scolari attraverso un campionamento stratificato comprendente i bambini dal primo all'ultimo anno di scuola primaria e proporzionalmente al loro numero per classe. A questo primo gruppo di 60 bambini in età scolare verrà applicato un test di diluizione isotopica del retinolo (RID) per la valutazione delle riserve corporee totali per confrontare i valori con le concentrazioni sieriche di esteri retinilici a digiuno al basale.

I restanti 98 alunni delle scuole saranno reclutati secondo un campionamento stratificato e proporzionalmente al loro numero per classe e divisi in due gruppi di 49 alunni in base al sesso (ovvero 49 femmine e 49 maschi). In ciascun partecipante verranno eseguiti due punti temporali di prelievo di sangue. Al partecipante verrà quindi assegnato in modo casuale il prelievo di sangue in H0, H2, H3, H4, H5 H6 H8, H10, H24, H72, H168 e H336 come specificato di seguito. Verrà generato un elenco di randomizzazione utilizzando tabelle di numeri casuali. Abbiamo scelto di effettuare la randomizzazione a blocchi piuttosto che a semplice randomizzazione perché il primo approccio ci consentirà di avere gruppi di confronto imparziali che avranno più o meno la stessa dimensione durante lo studio. Utilizzando la randomizzazione a blocchi, ci sarà sempre un numero quasi uguale di bambini in ciascun gruppo di studio.

Per questi gruppi di bambini verrà utilizzato il test MRDR (Modified Relative Dose Response), una misura qualitativa dello stato della vitamina A, per studiare l'assorbimento del 3,4-dideidroretinil acetato.

H0 (5), H2 (5), H3 (5), H4 (11), H5 (11) H6 (11) H8 (10), H10 (10), H24 (5), H72 (5), H168 ( 10), H336 (10)

III.4. Consapevolezza e sensibilizzazione della comunità Prima dell'inizio dello studio, condurremo una serie di incontri con i principali decisori e leader della comunità nell'area di studio come parte degli sforzi per aumentare la consapevolezza e mobilitare la comunità per lo studio. Questi incontri di sensibilizzazione e sensibilizzazione della comunità informeranno la comunità sull’esistenza e lo scopo dello studio, nonché sui benefici non solo per le loro comunità ma anche per il Paese e l’Africa in generale. Verranno spiegate le ragioni della scelta dell'area per ciascuno degli studi sull'uomo e il disegno proposto.

III.5. Reclutamento e screening

Come processo di screening, verrà stilato un elenco degli scolari idonei da cui verrà effettuata la selezione. I bambini potranno partecipare se soddisfano i seguenti criteri di screening:

III.5.1. Criteri di inclusione:

• Scolari dai 7 ai 12 anni
• Il tutore o il genitore del minore è disposto a fornire il consenso informato
• La famiglia del bambino prevede di rimanere residente nelle aree di studio durante il periodo di studio

III.5.2. Criteri di esclusione:

• Evidenza clinica di carenza di vitamina A a mis en forme : Anglais (Royaume-Uni)a mis en forme : Anglais (États-Unis)a mis en forme : Anglais (États-Unis)a mis en forme : Anglais (États-Unis)
• Malnutrizione grave (punteggio Z peso per età (WAZ) o punteggio Z altezza per età (HAZ) <-3 DS)
• Malattie gravi tra cui tubercolosi, infezione sintomatica da HIV
• Bambino di età <6 anni o >12 anni III.6. Variabili dello studio Dopo lo screening per l'idoneità, verrà ottenuto il consenso informato del bambino e del suo caregiver o genitore. Raccoglieremo informazioni socioeconomiche (ad es. reddito, istruzione, patrimonio familiare) ed eseguire misurazioni antropometriche (peso, altezza), valutazione dello stato dell'emoglobina e preparare strisci di sangue spessi e sottili per il rilevamento della malaria. Verrà raccolto un campione di feci per la determinazione dei parassiti intestinali.

III.7. Elaborazione dei campioni di sangue Per i 60 bambini coinvolti nell'analisi delle riserve corporee totali, prenderemo come target i bambini di età compresa tra 7 e 12 anni e verranno ottenute le caratteristiche di base dei soggetti. Al basale, su ciascun bambino verrà prelevato un campione di sangue venoso a digiuno (7 ml). Successivamente, verrà somministrata loro una dose orale di 1,0 μmol di [14,15]-13C2-retinil acetato, che sarà sintetizzato come pubblicato (Tanumihardjo, 2001), disciolto in olio di soia e somministrato con una pipetta a spostamento positivo da 250 microL. La dose sarà immediatamente seguita da un cucchiaino di olio d'oliva per favorirne l'assorbimento. I bambini consumeranno una colazione standardizzata a base di pane bianco e pasta di nocciole al gusto di cioccolato. Il sangue di follow-up verrà raccolto dagli infermieri della clinica Orodara il giorno 14 dopo la dose, conservato immediatamente in ghiaccio e trasportato all'Institut de Recherche en Sciences de la Santé situato a Bobo-Dioulasso per l'elaborazione.

I campioni di siero dello stesso gruppo di 60 scolari verranno suddivisi in tre provette e congelati a -80 gradi C.

Tutti i campioni verranno spediti o trasportati a mano all'Università del Wisconsin-Madison (UW) per l'analisi mediante gascromatografia-combustione-spettrometria di massa del rapporto isotopico (GCCIRMS) come descritto di seguito.

I campioni di sangue di base verranno analizzati anche per gli esteri retinilici e i carotenoidi del siero come descritto di seguito per volumi di campione bassi.

Un metodo simile è stato utilizzato in passato in Burkina Faso (Bationo et al., 2018), che ha rivelato un basso apporto di verdure. Tuttavia, da quando è stato condotto lo studio, l’olio arricchito con vitamina A è ora diventato ampiamente disponibile nel paese. Questo studio aggiungerà valore alla validazione degli esteri retinilici sierici come misura dell’eccesso di vitamina A.

Verrà studiata una pre-purificazione del retinolo dal siero utilizzando metodi di estrazione in fase solida (SPE) con conservante da un'aliquota per evitare l'onere normativo aggiuntivo della spedizione di campioni biologici umani (siero). Per prima cosa determineremo i protocolli ottimali presso l'Università del Wisconsin - Madison. Studi pilota hanno suggerito che la SPE in fase avanzata utilizzando colonne NH2 e solventi esano/acetato di etile hanno un recupero e una purezza molto elevati del retinolo dal siero e studieremo l'idrossitoluene butilato e l'alfa-tocoferolo come conservanti. Se la prepurificazione SPE viene utilizzata sul campo, pianificheremo di ripurificare il retinolo mediante HPLC prima dell'introduzione in GCCIRMS, quindi determineremo quale conservante non interferirà con la ripurificazione e l'analisi HPLC.

Un set di dati esistente nei bambini africani in età prescolare di età compresa tra 3 e 4 anni, per esplorare come la tecnica RID è influenzata dall’infiammazione al momento del dosaggio. È noto che il retinolo sierico e la proteina legante il retinolo vengono temporaneamente ridotti dall'infiammazione (Filteau et al., 1993; Thurnham et al., 2003). Ciò può influenzare le stime dello stato della vitamina A nelle popolazioni con alti livelli di infezioni cliniche o subcliniche (Suri et al., 2015; 2021). Tuttavia, il potenziale effetto dell’infiammazione sulla RID non è stato valutato in un ampio gruppo di bambini. Abbiamo calcolato le riserve corporee totali di vitamina A nei bambini del Burkina Faso, Etiopia, Camerun, Sud Africa e Tanzania. Lo stato infiammatorio è stato valutato misurando la proteina C-reattiva (CRP) e la glicoproteina alfa1-acida (AGP) ottenute dai campioni di sangue al momento della somministrazione. Esamineremo l'associazione tra riserve epatiche totali (TLR) basata sul test 13C-RID e valori continui di CRP e AGP, testando se la pendenza della relazione non è uguale a zero. Confronteremo anche le medie categoriche per il TLR utilizzando le seguenti quattro categorie di infiammazione: nessuna infiammazione, incubazione (solo CRP elevato (>5 mg/L)), convalescenza precoce (CRP e AGP elevati (>1 g/L)) e convalescenza tardiva (solo AGP elevato) utilizzando un test ANOVA per le differenze tra i gruppi.

Per il secondo studio trasversale che coinvolge il test MRDR, prenderemo ancora come target i bambini di età compresa tra 7 e 12 anni e verranno ottenute le caratteristiche basali del soggetto per valutare le curve di assorbimento utilizzando un analogo e per determinare se esiste una differenza utilizzando le capsule nelle curve di assorbimento.

Questo studio esaminerà l'assorbimento del 3,4-dideidroretinile acetato come analogia con l'acetato di retinile marcato in capsule rispetto alle dosi orali dirette in olio. Utilizzando le stesse procedure di sensibilizzazione e sensibilizzazione sopra indicate, i bambini verranno separati in sei gruppi di 15 e assegnati in modo casuale alla somministrazione di capsule o alla dose orale diretta con diversi punti temporali di raccolta dei campioni di sangue prelevati, da 0 a 7 ore dopo. Tutti i campioni verranno analizzati per il 3,4-dideidroretinolo e il 3,4-dideidroretinil esteri. La forma alcolica equivarrà a quella legata alla proteina legante il retinolo (RBP), mentre gli esteri rifletteranno le curve di assorbimento.

Tutti i bambini riceveranno 7,0 μmole di 3,4-dideidroretinile acetato disciolti in circa 200 μL di olio di soia. Il valore limite per la carenza di vitamina A per il test MRDR è 0,060, che corrisponde al rapporto 3,4-dideidroretinolo/retinolo da 4 a 6 ore dopo la somministrazione. Pertanto ogni bambino avrà questa misura. L'area sotto la curva di assorbimento dell'estere da 2 a 5 ore rivelerà la distribuzione dei chilomicroni dalla dose orale. Tutti i campioni verranno analizzati utilizzando il metodo standard da 250 μL per MRDR e un metodo UPLC esteso per 3,4-dideidroretinolo e 3,4-dideidroretinil esteri.

Lo studio si articolerà in due fasi:

Una fase iniziale sarà condotta dopo la stagione del mango (novembre-dicembre) e una seconda fase dello studio sarà condotta durante la stagione del mango (aprile-maggio).

III.8. Analisi di laboratorio

Analisi dei campioni mediante gascromatografia-combustione-spettrometria di massa del rapporto isotopico (GCCIRMS):

Siero: le procedure di estrazione del siero e la strumentazione per l'analisi GCCIRMS sono state precedentemente riportate (Howe et al., 2009; Gannon et al., 2014). In breve, il siero è stato scongelato a temperatura ambiente. A 0,75 mL (o tutto il siero disponibile) si aggiunge etanolo (1 x vol) per far precipitare le proteine, si aggiunge C23 beta-apo-carotenolo come standard interno e si eseguono estrazioni con esano 3 x 1 mL. Gli esani vengono riuniti, essiccati sotto azoto, risospesi in 100 μL di metanolo, congelati a -80 ⁰C per circa 5 minuti, centrifugati brevemente e iniettati nel sistema HPLC 1 per la quantificazione e la purificazione. Il sistema 1 è una colonna Gracesmart C18 (5 μm, 4,6 x 250 mm) con acetonitrile:acqua 92:8 a 1,0 mL/min. La frazione di retinolo è stata raccolta, essiccata sotto azoto e risospesa in 100 μL di metanolo per l'iniezione nel sistema 2. Il sistema 2 è una colonna identica con metanolo al 100% a 0,7 mL/min. La frazione di retinolo viene raccolta, essiccata sotto vuoto con un SPD1010 SpeedVac, risospesa in 4-6 μL di esano e 1-3 μL iniettati (per iniettare circa 75 ng) nel GC. È stato pubblicato il sistema GC/C/IRMS (Howe et al., 2009). La percentuale di atomi (At%) viene calcolata direttamente (Isodat versione 2.0) in riferimento all'anidride carbonica, che è calibrata rispetto a uno standard di saccarosio (NIST, 8542).

Analisi degli esteri retinilici e dei carotenoidi: i carotenoidi sierici e gli esteri retinilici saranno analizzati come pubblicato (Williams et al., 2021) presso il laboratorio del Dipartimento di Scienze Nutrizionali dell'Università del Wisconsin-Madison mediante cromatografia liquida a ultra prestazioni (Waters UPLC®) secondo un sistema di solventi precedentemente descritto (Gannon et al., 2018), ottimizzato per bassi volumi di campione e analiti desiderati. In breve, 150 μL di siero, o tutto il siero disponibile, vengono aliquotati in provette di vetro borosilicato (Fisher Scientific) in cui vengono aggiunti 100 μL di C-23 β-apo-carotenolo (densità ottica standard interna in metanolo ~1,0 a 325 nm) e 225 μL di etanolo aggiunto. I composti organici vengono estratti tre volte con 500 μL di esani, miscelati con un vortice e centrifugati con una forza centrifuga relativa di 1200 unità di gravità per 5 minuti. Gli strati di esano riuniti vengono essiccati in tubi di vetro a fondo conico sotto un flusso di azoto. L'estratto secco viene risospeso in 75 μL con una concentrazione di metanolo:dicloroetano 75:25, trasferito in fiale UPLC (Acque) e 6 μL iniettati nel sistema UPLC.

III.9. Sintesi organica per il completamento del progetto. Sintesi del 13C-retinile acetato per il completamento degli Obiettivi 1 e 2. Il 13C2-retinile acetato sarà sintetizzato utilizzando una procedura che è stata pubblicata in dettaglio da Tanumihardjo (2001). In breve, il C18-tetraene chetone viene sintetizzato dal β-ionone, un precursore disponibile in commercio, e accuratamente purificato. Utilizzando una procedura Whittig-Horner modificata, il tetraene chetone C-18 viene fatto reagire con il carbanione del trietilfosponoacetato marcato con 13C2 per aggiungere 2-13C allo scheletro della porzione retinolica. L'estere etilico risultante viene ridotto ad alcool ed esterificato ad acetato di retinile 13C2 con anidride acetica. L'isomero sintetico tutto trans viene purificato attentamente su allumina disattivata con acqua all'8% utilizzando solventi organici relativamente innocui e altamente volatili, ad esempio esani ed etere etilico. La preparazione risultante è caratterizzata mediante spettroscopia UV-VIS, TLC e HPLC. Per la conservazione a lungo termine, l'acetato di 14,15-13C2-retinile viene conservato disciolto in olio di soia a -80°C. Prepareremo le dosi finali in olio di soia (~200 μL/dose) poco prima dello studio e le porteremo a mano in ciascun sito di studio.

Sintesi del 3,4-dideidroretinile acetato per il completamento dell'Obiettivo 4: il Dr. Tanumihardjo sintetizza abitualmente il 3,4-dideidroretinile acetato per i Centers for Disease Control, Atlanta, Georgia, da utilizzare nelle loro valutazioni nutrizionali basate sulla popolazione. Pertanto, non prevediamo problemi nell'utilizzo delle attuali scorte a rotazione conservate a -80°C per la proposta valutazione dello stato della vitamina A nei neonati delle madri arruolate nello studio cinetico. Vengono pubblicate le procedure sintetiche utilizzate esclusivamente nel laboratorio Tanumihardjo (Barua e Ghosh 1972; Tanumihardjo, Barua, Olson, 1987). In breve, l'acido retinoico viene metilato con diazometano. Il metilretinoato risultante viene ossidato con biossido di manganese per formare 4=ossometilretinoato. Dopo un'attenta purificazione e cristallizzazione, il 4=oxo viene ridotto a 4-OH metilretinoato utilizzando boroidruro di sodio. Dopo la cristallizzazione in esani a -30°C per diversi giorni, il 4-OH viene disidratato con acido p-toluensolfonico e il risultante 3,4-dideidro-metilretinoato viene purificato e lasciato cristallizzare durante la notte. Infine, il 3,4-dideidro-metilretinoato viene ridotto a 3,4-dideidroretinolo con litio alluminio idruro e immediatamente acetilato in 3,4-dideidroretinile acetato, purificato, disciolto in olio di soia e conservato a -80°C fino alla preparazione e alla personalizzazione delle dosi. per studi individuali.

III.6. Autorizzazione etica I protocolli e i moduli di consenso informato saranno sottoposti a revisione etica nei comitati di revisione istituzionale dell'IRSS e saranno registrati presso il Pan African Clinical Trial Registry (www.pactr.org) database con un numero identificativo univoco. Abbiamo già esperienza di lavoro con il test RID nei bambini (Bationo et al., 2019).

IV. Piano di lavoro dello studio Programma temporale, IRSS Burkina Faso Attività Anno 1 Anno 2 Anno 3 Anno 4 Q1 Q2 Q3 Q4 Q1 Q2 Q3 Q4 Q1 Q2 Q3 Q4 Q1 Q2 Q3 Q4 Finalizzazione del protocollo Revisione etica e approvazione Sviluppo delle POS Preparazione del sito di studio Selezione e formazione del personale dello studio Primo ciclo del primo studio trasversale Preparazione e conservazione dei campioni Secondo ciclo del primo studio trasversale Preparazione e conservazione dei campioni Spedizione dei campioni Primo ciclo del secondo studio trasversale Preparazione e conservazione dei campioni Secondo ciclo del secondo studio trasversale Preparazione e conservazione dei campioni Spedizione dei campioni Analisi di laboratorio Gestione dei dati Divulgazione, locale, nazionale, internazionale