病気のペリインプラント組織におけるアポトーシスメカニズムのゲノムおよびプロテオーム分析

この研究は、サカリヤ大学医学部臨床研究委員会（承認番号：E-16214662-050.01.04-85,162-217）から倫理的承認を受け、ヘルシンキの宣言で概説された倫理原則に従って実施されました。 研究プロトコルはすべての参加者に徹底的に説明され、書面によるインフォームドコンセントが包含前に得られました。 募集は、2021年3月から2022年6月の間に行われ、サカリヤ大学歯周病学部の診療所に通った患者が関与しました。 これらの患者は、歯科インプラント療法後の維持期に、インプラント治療を積極的に受けているか、他のセンターに置かれた歯科インプラントに関連する合併症を呈していました。 72人の歯科インプラントを含む合計72人の参加者が研究に登録されました。 これらの参加者は、次のように分類されました：23人のインプラント粘膜炎を伴う全身的に健康な個人、25人のインプラント炎の個人、24人の健康な対照。 参加者の人口統計は、医療および歯科の歴史とともに、インタビュー中に収集されました。 包括的なフルマウス歯周試験が実施され、キャリブレーションされたマニュアル歯周剤プローブ（米国イリノイ州シカゴ、イリノイ州シカゴ）を使用して、各インプラントの周りの6つの部位で次の臨床パラメーターを測定しました：ケラチン化粘膜幅（KTW）、修正されたブリードインデックス（MBI）、修正（PD）インデックス（MGI）。 すべての評価は、単一の較正された歯周病専門医によって実行されました（DY、カッパ係数：0.92）。 ImageJソフトウェア（ImageJ、ウィスコンシン州、米国）を使用して、限界肺胞骨骨レベルと骨損失率のレントゲン写真評価を実施しました。 インプラント周囲組織の健康は、歯周病およびインプラント植物症の2017年分類に従って分類されました。

ベースライン評価後の臨床処置と組織サンプリングでは、すべての参加者がEFP治療ガイドラインで推奨されるように、口口の予防と口腔衛生動機付けを受けました。 インプラント周囲粘膜炎またはインプラント周囲炎と診断された患者は、単一の歯周病（DY）によって治療されました。 顆粒組織サンプルは、インプラント周囲の粘膜炎（非術）およびインプラント周囲炎（回復力、再建、または組み合わせの外科的アプローチ）の治療中に収集されました。 すべての顆粒および粘膜組織サンプルは、すぐにエッペンドルフチューブに入れられ、-80°Cで保存されました。 その後、サンプルは、生化学分析のためにドライアイス条件下で、ヘルシンキ大学のヘルシンキ大学病院の歯科研究所に輸送されました。 維持療法は、それぞれの治療プロトコルが完了すると、インプラント周囲疾患のすべての患者に提供されました。

Bcl-2ファミリータンパク質の分析解凍組織サンプルを最初に計量し、その後、使い捨てのメス（＃11および＃15、Feather Safety Razor Co.、Ltd、Osaka、Japan）を使用して小片に切断しました。 加工された組織断片は、4つの超純粋なジルコニウムミクロスフェア（直径3 mm）と400μLの溶解緩衝液を含む2 mLのチューブに移しました。 均質化は、高速組織ホモジナイザー（Tissuelyzer LT、Qiagen、Hilden、Germany）を使用して、それぞれ60秒の4サイクルでセットされ、過熱を防ぐために20秒間隔を置いて氷上で20秒間隔を置いて行いました。 均質化後、サンプルを10000 rpmで4分間遠心分離し、ジルコニウムビーズを除去しました。 超音波検査（UP50H、Hielscher、Teltow、Germany）は、0.5サイクル、3つの5秒サイクルで100％振幅で実行され、サイクルの間に20秒間隔が氷上で行われました。 次に、サンプルを10000 rpmで再び4分間遠心分離し、上清を新しいチューブに慎重に移しました。 サンプルの総タンパク質濃度は、ブラッドフォードアッセイによって測定されました。 Bcl-2ファミリータンパク質のレベルは、市販のキット（バイオプレックスプロRBMアポトーシスアッセイ、Bio-Rad Laboratories、Hercules、CA、USA、USA、USA、Bio-Plex Pro RBM Apottosisアッセイ）を備えたビーズベースのイムノアッセイシステム（Luminex XMAP、Luminex Corporation、TX、USA）を使用して定量化されました。

P. gingivalis gingipainおよびT. denticola dentilisin Immunoblot分析の免疫ブロット分析は、室温でサンプルをLaemmliのサンプルバッファーと混合し、電気泳動の前に5分間100°Cで加熱することにより実施しました。 事前に染色された低範囲分子量SDS-PAGE標準（Bio-Rad）を分子量マーカーとして使用しました。 P. gingivalisの場合、GingipainとT. Denticola Dentilisinは陽性対照を務めました。 すべてのサンプルとマーカーを8％SDS-PAGEゲルにロードし、150 Vで1時間電気泳動しました。 次に、ゲルをニトロセルロース膜に移し、ブロッキング溶液に浸し、それぞれのポリクローナル抗ジンジペインと抗デンチリシン抗体と一晩インキュベートしました。 インキュベーション後、膜を1％Triton X-100を含むTrisバッファー生理食塩水で4回すすいだ後、二次抗体として5 mL TBSTで抗リラビットIgG馬大根ペルオキシダーゼ（HRP）とインキュベートし、4回リンしました。 イムノブロットフィルムの検出と開発は、ダークルームで演奏され、分析物はフィルム上の暗いバンドとして視覚化されました。 その後、フィルムをスキャンし、GS-700イメージングデンシトメータースキャナーと数量1プログラム（Bio-Rad）を使用してバンド強度を定量化しました。