Genomiske og proteomiske analyser af apoptose-mekanismer i syge peri-implantatvæv

Undersøgelsen modtog etisk godkendelse fra det kliniske forskningsudvalg ved Sakarya University Fakultet for Medicin (godkendelsesnummer: E-16214662-050.01.04-85.162-217) og blev udført i overensstemmelse med de etiske principper, der er beskrevet i erklæringen af ​​Helsinki. Undersøgelsesprotokollen blev grundigt forklaret for alle deltagere, og der blev opnået skriftligt informeret samtykke inden deres optagelse. Rekruttering fandt sted mellem marts 2021 og juni 2022, der involverede patienter, der deltog i klinikkerne på Institut for Periodontologi, Sakarya University. Disse patienter var enten i vedligeholdelsesfasen efter tandimplantatterapi, aktivt gennemgik implantatbehandling eller præsenterede med komplikationer relateret til tandimplantater placeret i andre centre. I alt 72 deltagere, der omfattede 72 tandimplantater, blev indskrevet i undersøgelsen. Disse deltagere blev kategoriseret som følger: 23 systemisk sunde individer med peri-implantatslimhinde, 25 individer med peri-implantitis og 24 sunde kontroller. Deltagerdemografi sammen med medicinske og tandhistorier blev indsamlet under interviews. A comprehensive full-mouth periodontal examination was conducted, and the following clinical parameters were measured at six sites around each implant using a calibrated manual periodontal probe (Hu-Friedy, Chicago, IL, USA): keratinized mucosa width (KTW), modified bleeding index (mBI), probing depth (PD), modified plaque index (mPI), and modified Gingival Index (MGI). Alle vurderinger blev udført af en enkelt kalibreret periodontist (DY, Kappa -koefficient: 0,92). Radiografiske evalueringer af marginale alveolære knogliveauer og knogletabsprocent blev udført under anvendelse af ImageJ -software (ImageJ, Wisconsin, USA). Peri-implantat vævssundhed blev klassificeret i overensstemmelse med 2017-klassificeringen af ​​periodontale og peri-implantatsygdomme.

Kliniske procedurer og vævsprøvetagning Efter baselinevurderingerne gennemgik alle deltagere fuld mund-mundprofylakse og mundhygiejne-motivation som anbefalet af EFP-behandlingsretningslinjen. Patienter, der blev diagnosticeret med peri-implantatslimhinde eller peri-implantitis, blev behandlet af en enkelt periodontist (DY). Granuleringsvævsprøver blev opsamlet under behandlingen af ​​peri-implantatslimhinde (ikke-kirurgisk) og peri-implantitis (resektive, rekonstruktive eller kombinerede kirurgiske tilgange). Alle granulerings- og slimhindevævsprøver blev straks anbragt i Eppendorf -rør og opbevaret ved -80 ° C. Derefter blev prøverne transporteret til Institute of Dentistry, University of Turku og Helsinki University Hospital, University of Helsinki, under tørisforhold til biokemiske analyser. Vedligeholdelsesbehandling blev tilvejebragt til alle patienter med peri-implantatsygdomme efter afslutningen af ​​deres respektive behandlingsprotokoller.

Analyser af BCL-2-familieproteiner De optøede vævsprøver blev først vejet og derefter sektioneret i små stykker med engangscalk ( #11 og #15, Feather Safety Razor Co., Ltd, Osaka, Japan). De forarbejdede vævsfragmenter blev overført til 2 ml rør indeholdende fire ultrapur zirconiummikrosfærer (3 mM diameter) og 400 μl lysebuffer. Homogenisering blev udført under anvendelse af en højhastighedsvævets homogenizer (Tissuelyzer LT, Qiagen, Hilden, Tyskland) sat til 2000 o / min i fire cykler på 60 sekunder hver med 20 sekunders intervaller på is for at forhindre overophedning. Efter homogenisering blev prøverne centrifugeret ved 10000 o / min i 4 minutter, og zirconiumperlerne blev fjernet. Ultrasonication (UP50H, Hielscher, Teltow, Tyskland) blev udført ved 0,5 cyklus og 100% amplitude i tre 5-sekunders cyklusser med 20-sekunders intervaller på is mellem cyklusserne. Prøverne blev derefter centrifugeret igen ved 10000 o / min i 4 minutter, og supernatanterne blev omhyggeligt overført til nye rør. De samlede proteinkoncentrationer i prøverne blev målt ved Bradford -assayet. Niveauerne af BCL-2-familieproteiner blev kvantificeret under anvendelse af et perlebaseret immunoassay-system (Luminex XMAP, Luminex Corporation, Austin, TX, USA) med kommercielt tilgængelige sæt (Bio-Plex Pro RBM Apoptosis Assays, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) efter fabrikantens instruktioner.

Immunoblot -analyser af P. gingivalis gingipain og T. denticola dentilisin Immunoblot -analyser blev udført ved at blande prøverne ved stuetemperatur med Laemmlis prøvebuffer og opvarme dem ved 100 ° C i 5 minutter før elektroforese. Pre-farvede molekylvægt i lav rækkevidde SDS-PAGE-standarder (Bio-Rad) blev anvendt som molekylvægtmarkører. For P. gingivalis tjente gingipain og T. denticola dentilisin som positive kontroller. Alle prøver og markører blev fyldt på 8% SDS-PAGE geler og elektroforeret ved 150 V i en time. Gelerne blev derefter overført til nitrocellulosemembraner, gennemvædet i blokerende opløsning og inkuberet natten over med de respektive polyklonale anti-gingipain og anti-te-te-te-dentilisin antistoffer. Efter inkubation blev membranerne skyllet fire gange med Tris-bufferet saltvand indeholdende 1% Triton X-100, derefter inkuberet med antirabbit IgG-heste-radise peroxidase (HRP) i 5 ml TBST som et sekundært antistof og skyllet fire gange. Påvisning og udvikling af immunoblot -filmene blev udført i et mørkt rum, med analytter visualiseret som mørke bånd på filmene. Filmene blev efterfølgende scannet, og båndintensiteter blev kvantificeret under anvendelse af GS-700 billeddannelsesdensitometer-scanner og det mængde et program (Bio-Rad).