Analizy genomowe i proteomiczne mechanizmów apoptozy w chorych tkankach okołoprzepustowych

Badanie otrzymało zatwierdzenie etyczne Komitetu ds. Badań Klinicznych Wydziału Medycznego Uniwersytetu Sakarya (numer zatwierdzenia: E-1621462-050.01.04-85,162-217) i zostało przeprowadzone zgodnie z zasadami etycznymi określonymi w Deklaracji Helsiń. Protokół badania został dokładnie wyjaśniony wszystkim uczestnikom, a przed ich włączeniem uzyskano pisemną świadomą zgodę. Rekrutacja odbyła się między marcem 2021 r. Do czerwca 2022 r., Z udziałem pacjentów, którzy uczęszczali do klinik Departamentu Periodontologii, Sakarya University. Ci pacjenci byli albo w fazie podtrzymującej po terapii implantów dentystycznych, aktywnie poddawaniu się leczeniu implantów lub wykazywanie powikłań związanych z implantami dentystycznymi umieszczonymi w innych ośrodkach. W badaniu włączono 72 uczestników, obejmujących 72 implanty dentystyczne. Uczestnicy ci zostali skategoryzowani w następujący sposób: 23 zdrowe systemowo osoby z zapaleniem błony śluzowej około implantu, 25 osób z zapaleniem okołoprzepustowym i 24 zdrowe kontrole. Podczas wywiadów pobierano dane demograficzne uczestników wraz z historiami medycznymi i dentystycznymi. Przeprowadzono kompleksowe badanie przyzębia w pełni, a następujące parametry kliniczne mierzono w sześciu miejscach wokół każdego implantu za pomocą skalibrowanej ręcznej sondy przyzębia (HU-Friedy, Chicago, IL, USA): Keratynizowana szerokość błony śluzowej (KTW), zmodyfikowane wskaźniki krwawienia (MBI), głębokość sondowania (PD), zmodyfikowana indeks błony śluzowej MPI (KTW), zmodyfikowane wskaźnik krwawienia (MBI). indeks (MGI). Wszystkie oceny przeprowadzono przez pojedynczego skalibrowanego periodontysty (DY, Kappa Współczynnik: 0,92). Oceny radiograficzne poziomów krańcowych kości pęcherzyków pęcherzykowych i odsetek utraty kości przeprowadzono przy użyciu oprogramowania ImageJ (ImageJ, Wisconsin, USA). Zdrowie tkanki około implantu zostało sklasyfikowane zgodnie z klasyfikacją chorób przyzębia i eri-implantu w 2017 r.

Procedury kliniczne i pobieranie próbek tkanek Po podstawowych ocenie wszyscy uczestnicy przeszli profilaktykę pełnoprzepustową i motywację higieny jamy ustnej zgodnie z zaleceniami wytycznymi dotyczącymi leczenia EFP. Pacjenci ze zdiagnozowanym zapaleniem błony śluzowej około implantacji lub zapaleniem około implantu leczyli pojedynczy periodontysta (DY). Próbki tkanki ziarnistości pobrano podczas leczenia zapalenia błony śluzowej około implantacji (niechirurgiczne) i zapalenia okołoprzepustowego (rezerwowe, rekonstrukcyjne lub połączone chirurgiczne podejścia). Wszystkie próbki granulacji i tkanki błony śluzowej natychmiast umieszczono w rurkach Eppendorf i przechowywano w -80 ° C. Następnie próbki zostały przetransportowane do Instytutu Stomatologii, University of Turku i Helsinek University Hospital, University of Helsinki, w suchych warunkach lodowych do analiz biochemicznych. Po zakończeniu ich protokołów leczenia zapewniono terapię podtrzymującą chorobom okołoprzepustowym.

Analizy białek rodzinnych BCL-2 rozmrożone próbki tkanki najpierw zważono, a następnie podzielenia na małe kawałki z jednorazowymi skalpelami ( #11 i 15, Feather Safety Razor Co., Ltd, Osaka, Japonia). Przetworzone fragmenty tkanki przeniesiono do 2 ml rur zawierających cztery ultraczyste mikrosfery cyrkonu (średnica 3 mm) i 400 μl buforu do lizy. Homogenizację przeprowadzono przy użyciu szybkiego homogenizatora tkankowego (Tissuelyzer LT, Qiagen, Hilden, Niemcy) na 2000 rpm na cztery cykle po 60 sekund każda, z 20 sekundami na lodzie, aby zapobiec przegrzaniu. Po homogenizacji próbki wirowano przy 10000 rpm przez 4 minuty, a perełki cyrkonu usunięto. Ultradźwiękowe (UP50H, Hielscher, Teltow, Niemcy) przeprowadzono w 0,5 cyklu i 100% amplitudy w trzech 5-sekundowych cyklach, z 20-sekundowymi odstępami lodu między cyklami. Próbki następnie wirowano ponownie przy 10000 obr / min przez 4 minuty, a supernatanty starannie przeniesiono do nowych rur. Całkowite stężenia białka w próbkach mierzono za pomocą testu Bradforda. Poziomy białek rodziny Bcl-2 zostały określone ilościowo przy użyciu systemu immunologicznego opartego na koralikach (Luminex XMAP, Luminex Corporation, Austin, Teksas, USA) z dostępnymi w handlu zestawami producenta (Bio-Plex Pro RBM Apoptosis Laboratories, Herkules, CA, USA) zgodnie z instrukcjami producenta.

Analizy immunoblot analizy immunoblotu P. gingivalis i immunoblot z denticola denticola przeprowadzono przez zmieszanie próbek w temperaturze pokojowej z buforem próbki Laemmli i ogrzewając je w 100 ° C przez 5 minut przed elektroforezą. Zastosowane standardy SDS-PAGE o niskim zasięgu (Bio-Rad) zastosowano jako markery masy cząsteczkowej. W przypadku P. gingivalis, Gingipain i T. denticola Dentilisin służyli jako kontrole pozytywne. Wszystkie próbki i markery zostały załadowane na 8% żele SDS-PAGE i elektroforesowane przy 150 V przez godzinę. Żele następnie przeniesiono na błony nitrocelulozowe, namoczono roztworem blokującym i inkubowano przez noc z odpowiednimi przeciwciałami przeciwgniżonowymi i przeciwwstanymi przeciwgapinowymi i anty-dentilisinami. Po inkubacji błony przepłukano czterokrotnie solą fizjologiczną buforowaną Tris zawierającą 1% Triton X-100, a następnie inkubowano z peroksydazą rzodkiewki konnej IgG przeciwrabbit IgG (HRP) w 5 ml TBST jako wtórne przeciwciało i wydawano czterokrotnie. Wykrywanie i opracowanie filmów immunoblot przeprowadzono w ciemnym pokoju, z analizami wizualizowanymi jako ciemne pasma na filmach. Filmy zostały następnie zeskanowane, a intensywność pasm określono ilościowo przy użyciu skanera Densitometru GS-700 i programu Ilości One (Bio-Rad).