Геномный и протеомный анализ механизмов апоптоза в больной пери-имплантационной ткани

Исследование получило этическое одобрение Комитета по клиническим исследованиям Университета Сакарья (номер утверждения: E-16214662-050.01.04-85,162-217) и проводилось в соответствии с этическими принципами, изложенными в декларации Хельсинкси. Протокол исследования был тщательно объяснен всем участникам, и письменное информированное согласие было получено до их включения. Набор персонала состоялся в период с марта 2021 года по июнь 2022 года с участием пациентов, которые посещали клиники факультета пародонтологии, Университет Сакарья. Эти пациенты находились либо в фазе поддержания после лечения зубных имплантатов, активно подвергаясь лечению имплантатов, либо с осложнениями, связанными с зубными имплантатами, размещенными в других центрах. В ходе исследования было включено 72 участника, охватывающие 72 зубных имплантата. Эти участники были классифицированы следующим образом: 23 системно здоровых людей с мукозитом перимиплантата, 25 человек с перимиплантитом и 24 здоровых контрольных. Демография участников, наряду с медицинской и зубной историей, была собрана во время интервью. A comprehensive full-mouth periodontal examination was conducted, and the following clinical parameters were measured at six sites around each implant using a calibrated manual periodontal probe (Hu-Friedy, Chicago, IL, USA): keratinized mucosa width (KTW), modified bleeding index (mBI), probing depth (PD), modified plaque index (mPI), and modified Индекс десны (MGI). Все оценки проводились с помощью одного калиброванного периодонточа (DY, коэффициент каппа: 0,92). Рентгенографические оценки маргинальных уровней альвеолярных костей и процентов потери костей были проведены с использованием программного обеспечения ImageJ (ImageJ, Висконсин, США). Здоровье тканей перимиплантации было классифицировано в соответствии с классификацией заболеваний пародонта и пери-имплантатов 2017 года.

Клинические процедуры и выборка тканей. После исходных оценки все участники профилактика и гигиенической мотивации полового рта, как это рекомендовано в Руководстве по лечению EFP. Пациентам с диагнозом перимиплантата мукозит или перимиплантита лечили одним пародонтоном (DY). Образцы грануляции ткани собирали во время лечения мукозита перимиплантата (нехирургический) и перимиплантит (рецептивный, реконструктивный или комбинированные хирургические подходы). Все образцы грануляции и слизистой оболочки немедленно помещали в трубки Eppendorf и хранили при -80 ° C. Впоследствии образцы были доставлены в Институт стоматологии, Университет Турку и Хельсинки Университетского больницы, Университет Хельсинки, в условиях сухого льда для биохимического анализа. Поддерживающая терапия была предоставлена ​​всем пациентам с заболеваниями перимиплантата после завершения их соответствующих протоколов лечения.

Анализ белков семейства BCL-2. Образцы тканей были сначала взвешены и впоследствии разделены на мелкие кусочки с одноразовыми скальпелями ( #11 и #15, Feather Safety Razor Co., Ltd, Осака, Япония). Обработанные фрагменты ткани переносили в 2 мл трубок, содержащих четыре ультрапирных микросферы циркония (диаметр 3 мм) и 400 мкл буфера для лизиса. Гомогенизацию проводили с использованием высокоскоростного гомогенизатора ткани (Tissuelyzer LT, Qiagen, Hilden, Germany), установленного на 2000 об / мин в течение четырех циклов по 60 секунд каждый, с 20-секундными интервалами на льду, чтобы предотвратить перегрев. После гомогенизации образцы центрифугировали при 10000 об / мин в течение 4 минут, а гранулы циркония удаляли. Ультразвуковая (Hielscher, Teltow, Teltow, Germany) проводили ультразвуковой (Hielscher, Teltow, Germany) с амплитудой 0,5 и 100% в трех 5-секундных циклах, с 20 секундными интервалами на льду между циклами. Затем образцы снова центрифугировали со скоростью 10000 об / мин в течение 4 минут, а супернатанты были тщательно перенесены в новые трубки. Общие концентрации белка в образцах измеряли с помощью анализа Брэдфорда. Уровни белков семейства BCL-2 определяли количественно с использованием системы иммуноанализа на основе шариков (Luminex XMAP, Luminex Corporation, Austin, TX, USA) с коммерчески доступными наборами (анализы Apoptosis Bio-Plex Pro RBM, лаборатории Bio-Rad, Hercules, CA, USA), следуя инструкциям производителя.

Анализ иммуноблот P. gingivalis gingipain и T. denticola immunoblot -анализа T. denticola проводили путем смешивания образцов при комнатной температуре с буфером для образцов Laemmli и нагреванием их при 100 ° C в течение 5 минут до электрофореза. Предварительно окрашенные стандарты SDS-PAGE с низким уровнем массы (Bio-Rad) использовали в качестве маркеров молекулярной массы. Для P. gingivalis, Gingipain и T. denticola dentilisin служил положительным контролем. Все образцы и маркеры загружали на 8% SDS-PAGE Gels и электрофорели при 150 В в течение одного часа. Затем гели переносили на нитроцеллюлозные мембраны, пропитывали в блокирующем растворе и инкубировали в течение ночи с соответствующими поликлональными анти-гингипейнами и антителами против дентилизина. После инкубации мембраны четыре раза промывали трис-буферным физиологическим раствором, содержащим 1% Triton X-100, затем инкубировали с антираббит-конной пероксидазой (HRP) в 5 мл TBST в качестве вторичного антитела и промывали четыре раза. Обнаружение и разработка пленок иммуноблот были выполнены в темной комнате, а аналиты визуализировались как темные группы на фильмах. Впоследствии пленки были отсканированы, а интенсивности полос были количественно определены с использованием сканера денситометра GS-700 и программы One One One (Bio-Rad).