Genomische en proteomische analyses van apoptose-mechanismen in zieke peri-implantaatweefsel

De studie ontving ethische goedkeuring van het Clinical Research Committee van de Sakarya University Faculteit der Geneeskunde (goedkeuringsnummer: E-16214662-050.01.04-85,162-217) en werd uitgevoerd in overeenstemming met de ethische principes in de verklaring van Helsinki. Het studieprotocol werd grondig uitgelegd aan alle deelnemers en schriftelijke geïnformeerde toestemming werd verkregen voorafgaand aan hun opname. Werving vond plaats tussen maart 2021 en juni 2022, waarbij patiënten betrokken waren die de klinieken van de afdeling Periodontologie, Sakarya University bijwoonden. Deze patiënten bevonden zich in de onderhoudsfase na therapie in de tandheelkundige implantaat, ondergingen actief de behandeling van implantaten of het presenteren van complicaties met betrekking tot tandheelkundige implantaten die in andere centra werden geplaatst. Een totaal van 72 deelnemers, die 72 tandheelkundige implantaten omvatten, werden ingeschreven voor het onderzoek. Deze deelnemers werden als volgt gecategoriseerd: 23 systemisch gezonde personen met peri-implantaat mucositis, 25 personen met peri-implantitis en 24 gezonde controles. Demografie van de deelnemers, samen met medische en tandheelkundige geschiedenis, werden verzameld tijdens interviews. A comprehensive full-mouth periodontal examination was conducted, and the following clinical parameters were measured at six sites around each implant using a calibrated manual periodontal probe (Hu-Friedy, Chicago, IL, USA): keratinized mucosa width (KTW), modified bleeding index (mBI), probing depth (PD), modified plaque index (mPI), and modified Gingival Index (MGI). Alle beoordelingen werden uitgevoerd door een enkele gekalibreerde parodontist (DY, Kappa -coëfficiënt: 0,92). Radiografische evaluaties van marginale alveolaire botniveaus en botverliespercentages werden uitgevoerd met behulp van ImageJ -software (ImageJ, Wisconsin, VS). Peri-implantaatweefselgezondheid werd geclassificeerd in overeenstemming met de 2017 classificatie van parodontale en peri-implantaatziekten.

Klinische procedures en weefselbemonstering Na de basisbeoordelingen ondergingen alle deelnemers profylaxe met volledige mond en orale hygiëne-motivatie zoals aanbevolen door EFP-behandelingsrichtlijn. Patiënten met de diagnose peri-implantaat mucositis of peri-implantitis werden behandeld door een enkele parodontist (DY). Granulatieweefselmonsters werden verzameld tijdens de behandeling van peri-implantaat mucositis (niet-chirurgisch) en peri-implantitis (resectieve, reconstructieve of gecombineerde chirurgische benaderingen). Alle granulatie- en mucosale weefselmonsters werden onmiddellijk in Eppendorf -buizen geplaatst en bewaard bij -80 ° C. Vervolgens werden de monsters getransporteerd naar het Institute of Dentistry, University of Turku en Helsinki University Hospital, University of Helsinki, onder droge ijsomstandigheden voor biochemische analyses. Onderhoudstherapie werd verstrekt aan alle patiënten met peri-implantaatziekten na voltooiing van hun respectieve behandelingsprotocollen.

Analyses van BCL-2 familie-eiwitten De ontdooide weefselmonsters werden eerst gewogen en vervolgens in kleine stukjes gesneden met wegwerp scalpels ( #11 en #15, Feather Safety Razor Co., Ltd, Osaka, Japan). De verwerkte weefselfragmenten werden overgebracht naar 2 ml buizen die vier ultrazekere zirkoniummicrosferen (3 mm diameter) en 400 ul lysisbuffer bevatten. Homogenisatie werd uitgevoerd met behulp van een high-speed weefsel homogenizer (Tissuelyzer LT, Qiagen, Hilden, Duitsland) ingesteld op 2000 tpm gedurende vier cycli van 60 seconden elk, met 20 seconden intervallen op ijs om oververhitting te voorkomen. Na homogenisatie werden de monsters 4 minuten gecentrifugeerd bij 10000 tpm en werden de zirkoniumparels verwijderd. Ultrasone (UP50H, Hielscher, Teltow, Duitsland) werd uitgevoerd bij 0,5 cyclus en 100% amplitude in drie cycli van 5 seconden, met intervallen van 20 seconden op ijs tussen de cycli. De monsters werden vervolgens 4 minuten opnieuw gecentrifugeerd bij 10000 tpm en de supernatanten werden zorgvuldig overgebracht naar nieuwe buizen. Totale eiwitconcentraties in de monsters werden gemeten door de Bradford -test. De niveaus van BCL-2-familie-eiwitten werden gekwantificeerd met behulp van een op kralen gebaseerd immunoassay-systeem (Luminex XMAP, Luminex Corporation, Austin, TX, VS) met commercieel beschikbare kits (Bio-Plex Pro RBM Apoptosis Assays, Bio-Rad Laboratories, Hercules, Ca, USA) volgend op de fabrikant-instructies.

Immunoblotanalyses van P. gingivalis gingipain en T. denticola dentilisine immunoblot -analyses werden uitgevoerd door de monsters bij kamertemperatuur te mengen met de monsterbuffer van Laemmli en deze 5 minuten voor elektroforese te verwarmen. Pre-gebeekteld molecuulgewicht SDS-PAGE-normen met lage afstand (Bio-Rad) werden gebruikt als molecuulgewichtsmarkers. Voor P. gingivalis dienden Gingipain en T. denticola dentilisin als positieve controles. Alle monsters en markers werden geladen op 8% SDS-PAGE-gels en geëlektroforeerd bij 150 V gedurende een uur. De gels werden vervolgens overgebracht op nitrocellulosemembranen, gedrenkt in blokkeeroplossing en gedurende de nacht geïncubeerd met de respectieve polyklonale anti-gigepain en anti-dentilisine-antilichamen. Na incubatie werden de membranen vier keer gespoeld met Tris-gebufferde zoutoplossing die 1% Triton X-100 bevatte, vervolgens geïncubeerd met Antirabbit IgG Horse Radish-peroxidase (HRP) in 5 ml TBST als secundair antilichaam en vier keer gespoeld. Detectie en ontwikkeling van de immunoblotfilms werden uitgevoerd in een donkere kamer, met analyten gevisualiseerd als donkere banden op de films. De films werden vervolgens gescand en bandintensiteiten werden gekwantificeerd met behulp van de GS-700 Imaging Densitometer-scanner en het Quantity One-programma (Bio-Rad).