Análisis genómicos y proteómicos de los mecanismos de apoptosis en tejido peri-implantado enfermo

El estudio recibió la aprobación ética del Comité de Investigación Clínica de la Facultad de Medicina de la Universidad de Sakarya (número de aprobación: E-16214662-050.01.04-85,162-217) y se realizó de acuerdo con los principios éticos se describen en la declaración de Helsinki. El protocolo de estudio se explicó a fondo a todos los participantes, y se obtuvo el consentimiento informado por escrito antes de su inclusión. El reclutamiento tuvo lugar entre marzo de 2021 y junio de 2022, involucrando a pacientes que asistieron a las clínicas del Departamento de Periodontología, Universidad de Sakarya. Estos pacientes estaban en la fase de mantenimiento después de la terapia de implantes dentales, sometidos activamente al tratamiento de implantes o presentando complicaciones relacionadas con implantes dentales colocados en otros centros. En el estudio se inscribieron un total de 72 participantes, que abarcaban 72 implantes dentales. Estos participantes fueron categorizados de la siguiente manera: 23 individuos sistémicamente sanos con mucositis periimplante, 25 individuos con periimplantitis y 24 controles sanos. La demografía participante, junto con antecedentes médicos y dentales, se recopilaron durante las entrevistas. A comprehensive full-mouth periodontal examination was conducted, and the following clinical parameters were measured at six sites around each implant using a calibrated manual periodontal probe (Hu-Friedy, Chicago, IL, USA): keratinized mucosa width (KTW), modified bleeding index (mBI), probing depth (PD), modified plaque index (mPI), and modified Índice Gingival (MGI). Todas las evaluaciones fueron realizadas por un solo periodontista calibrado (coeficiente DY, Kappa: 0.92). Las evaluaciones radiográficas de los niveles óseos alveolares marginales y los porcentajes de pérdida ósea se realizaron utilizando el software ImageJ (ImageJ, Wisconsin, EE. UU.). La salud del tejido peri-implant se clasificó de acuerdo con la clasificación de las enfermedades periodontales y periimplantes.

Procedimientos clínicos y muestreo de tejidos Después de las evaluaciones de referencia, todos los participantes se sometieron a profilaxis de boca completa y motivación de higiene oral según lo recomendado por la guía de tratamiento de la EFP. Los pacientes diagnosticados con mucositis periimplante o periimplantitis fueron tratados por un solo periodontista (DY). Se recogieron muestras de tejido de granulación durante el tratamiento de la mucositis periimplante (no quirúrgica) y la periimprantitis (enfoques quirúrgicos resectados, reconstructivos o combinados). Todas las muestras de granulación y tejido mucoso se colocaron inmediatamente en tubos de Eppendorf y se almacenaron a -80 ° C. Posteriormente, las muestras fueron transportadas al Instituto de Odontología, Universidad de Turku y Helsinki University Hospital, Universidad de Helsinki, en condiciones de hielo seco para análisis bioquímicos. La terapia de mantenimiento se proporcionó a todos los pacientes con enfermedades periimplantes al finalizar sus respectivos protocolos de tratamiento.

Análisis de proteínas de la familia Bcl-2 Las muestras de tejido descongelado se pesaron primero y posteriormente se seccionaron en pequeñas piezas con escalpelos desechables ( #11 y #15, Feather Safety Razor Co., Ltd, Osaka, Japón). Los fragmentos de tejido procesados ​​se transfirieron a tubos de 2 ml que contienen cuatro microesferas de circonio ultrapure (3 mm de diámetro) y 400 μl de tampón de lisis. La homogeneización se realizó utilizando un homogeneizador de tejido de alta velocidad (Tissuelyzer LT, Qiagen, Hilden, Alemania) establecido a 2000 rpm durante cuatro ciclos de 60 segundos cada uno, con 20 segundos de intervalos en hielo para evitar el sobrecalentamiento. Después de la homogeneización, las muestras se centrifugaron a 10000 rpm durante 4 minutos, y se eliminaron las perlas de circonio. La ecografía (UP50H, Hielscher, Teltow, Alemania) se realizó en 0.5 ciclo y amplitud del 100% en tres ciclos de 5 segundos, con intervalos de 20 segundos en hielo entre los ciclos. Las muestras se centrifugaron nuevamente a 10000 rpm durante 4 minutos, y los sobrenadantes se transfirieron cuidadosamente a nuevos tubos. Las concentraciones totales de proteínas en las muestras se midieron mediante el ensayo de Bradford. Los niveles de proteínas de la familia Bcl-2 se cuantificaron utilizando un sistema de inmunoensayo basado en perlas (Luminex XMAP, Luminex Corporation, Austin, TX, EE. UU.) Con kits disponibles comercialmente (ensayos de apoptosis Bio-Plex Pro RBM, Laboratorios Bio-Rad, Herculadores, CA, EE. UU.) Siguiendo las instrucciones del fabricante del fabricante.

Los análisis de inmunotransferencia de P. gingivalis gingipain y T. denticola dentilisina se realizaron análisis de inmunotransferencia mezclando las muestras a temperatura ambiente con el tampón de muestra de Laemmli y calentándolos a 100 ° C durante 5 minutos antes de la electroforesis. Se usaron estándares SDS-PAGE de peso molecular de bajo alcance de bajo alcance (Bio-Rad) como marcadores de peso molecular. Para P. gingivalis, Gingipain y T. denticola dentilisina sirvieron como controles positivos. Todas las muestras y marcadores se cargaron en geles SDS-PAGE al 8% y se electroforesis a 150 V durante una hora. Luego, los geles se transfirieron a membranas de nitrocelulosa, empapadas en solución de bloqueo y se incubaron durante la noche con los respectivos anticuerpos anti-cipa de cipina policlonales y anti-dentilisina. Después de la incubación, las membranas se enjuagaron cuatro veces con solución salina tamponada con tris que contenía 1% Triton X-100, luego se incubaron con peroxidasa de rábano de caballo de IgG antirrabbit (HRP) en 5 ml de TBST como anticuerpo secundario y se redujo cuatro veces. La detección y el desarrollo de las películas de inmunotransferencia se realizaron en una habitación oscura, con analitos visualizados como bandas oscuras en las películas. Posteriormente, las películas se escanearon, y las intensidades de la banda se cuantificaron utilizando el escáner del densitómetro de imágenes GS-700 y el programa Cantidad One (Bio-Rad).