Análises genômicas e proteômicas de mecanismos de apoptose em tecido peri-implante doente

O estudo recebeu aprovação ética do Comitê de Pesquisa Clínica da Faculdade de Medicina da Universidade Sakarya (número de aprovação: E-16214662-050.01.04-85,162-217) e foi realizado de acordo com os princípios éticos descritos na declaração de Helsinque. O protocolo do estudo foi explicado minuciosamente a todos os participantes e o consentimento informado por escrito foi obtido antes de sua inclusão. O recrutamento ocorreu entre março de 2021 e junho de 2022, envolvendo pacientes que participaram das clínicas do Departamento de Periodontologia, Universidade de Sakarya. Esses pacientes estavam na fase de manutenção após a terapia dentária, passando ativamente no tratamento do implante ou apresentando complicações relacionadas a implantes dentários colocados em outros centros. Um total de 72 participantes, abrangendo 72 implantes dentários, foram matriculados no estudo. Esses participantes foram categorizados da seguinte forma: 23 indivíduos sistemicamente saudáveis ​​com mucosite peri-implante, 25 indivíduos com peri-implantite e 24 controles saudáveis. A demografia dos participantes, juntamente com histórias médicas e odontológicas, foi coletada durante as entrevistas. Um exame periodontal abrangente de boca cheia foi realizada e os seguintes parâmetros clínicos foram medidos em seis locais ao redor de cada implante usando uma sonda periodontal manual calibrada (Hu-Friedy, Chicago, IL, EUA): Modificado Modificado (Modificado), Modificado), o Modificado de Modificado (Modificado), PLEPIF), PLUMIFEND ENCOMENDENHEND (MODIIF), PLUMIF), PLUMIFEND (MODIOSIFT), PLUMIFEND (MODIOSIFT), PLUMIFEND (MODIOSIFT), PLUMIFEND (MODIOSIF), PLUMIFEND (MODIOSIF), PLUMIFEND (MODIIF), PLUMEND (PLUMIF), PLEIF). Índice gengival (MGI). Todas as avaliações foram realizadas por um único periodontista calibrado (DY, coeficiente de Kappa: 0,92). As avaliações radiográficas dos níveis ósseas alveolares marginais e das porcentagens de perda óssea foram realizadas usando o software ImageJ (ImageJ, Wisconsin, EUA). A saúde do tecido peri-implante foi classificada de acordo com a classificação de 2017 de doenças periodontais e peri-implantes.

Procedimentos clínicos e amostragem de tecidos Após as avaliações da linha de base, todos os participantes foram submetidos à profilaxia de boca cheia e motivação de higiene oral, conforme recomendado pela diretriz de tratamento da EFP. Pacientes diagnosticados com mucosite peri-implante ou peri-implantite foram tratados por um único periodontista (DY). As amostras de tecido de granulação foram coletadas durante o tratamento de mucosite peri-implante (não cirúrgica) e peri-implantite (abordagens cirúrgicas ressecivas, reconstrutivas ou combinadas). Todas as amostras de granulação e tecido da mucosa foram imediatamente colocadas em tubos Eppendorf e armazenadas a -80 ° C. Posteriormente, as amostras foram transportadas para o Instituto de Odontologia, Universidade de Turku e Hospital Universitário de Helsinque, Universidade de Helsinque, em condições de gelo seco para análises bioquímicas. A terapia de manutenção foi fornecida a todos os pacientes com doenças peri-implantes após a conclusão de seus respectivos protocolos de tratamento.

Análises das proteínas da família Bcl-2 As amostras de tecido descongeladas foram pesadas pela primeira vez e posteriormente seccionadas em pequenos pedaços com bisturis descartáveis ​​( #11 e #15, Feather Safety Razor Co., Ltd, Osaka, Japão). Os fragmentos de tecido processado foram transferidos para 2 ml de tubos contendo quatro microesferas de zircônio ultrapura (3 mm de diâmetro) e 400 μl de tampão de lise. A homogeneização foi realizada usando um homogeneizador de tecido de alta velocidade (Tissuelyzer LT, Qiagen, Hilden, Alemanha), situado a 2000 rpm por quatro ciclos de 60 segundos cada, com intervalos de 20 segundos no gelo para evitar superaquecimento. Após a homogeneização, as amostras foram centrifugadas a 10000 rpm por 4 minutos e as esferas de zircônio foram removidas. A ultrassom (UP50H, Hielscher, Teltow, Alemanha) foi realizada em um ciclo de 0,5 e 100% em três ciclos de 5 segundos, com intervalos de 20 segundos no gelo entre os ciclos. As amostras foram então centrifugadas novamente a 10000 rpm por 4 minutos e os sobrenadantes foram cuidadosamente transferidos para novos tubos. As concentrações totais de proteína nas amostras foram medidas pelo ensaio de Bradford. Os níveis de proteínas da família Bcl-2 foram quantificados usando um sistema de imunoensaio à base de contas (Luminex XMAP, Luminex Corporation, Austin, TX, EUA) com kits disponíveis comercialmente (Bio-Plex Pro RBM apoptose, ensaios de Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) a seguir os fabricantes do fabricante.

As análises de imunotransferência de análises de imunotransferência de P. gingivalis e T. denticola dentilisina foram realizadas misturando as amostras à temperatura ambiente com o tampão de amostra de Laemmli e aquecendo -as a 100 ° C por 5 minutos antes da eletroforese. Os padrões de SDS-PAGE de baixo peso de baixo alcance pré-corados (Bio-Rad) foram usados ​​como marcadores de peso molecular. Para P. gingivalis, Gingipain e T. denticola dentilisina serviram como controles positivos. Todas as amostras e marcadores foram carregados em géis de 8% de SDS-PAGE e eletroforesado a 150 V por uma hora. Os géis foram então transferidos para as membranas de nitrocelulose, embebidos em solução de bloqueio e incubados durante a noite com os respectivos anticorpos policlonais anti-genegipaipa e anti-desdilisina. Após a incubação, as membranas foram lavadas quatro vezes com solução salina tamponada com Tris contendo 1% de Triton X-100, depois incubada com o cavalo de rabanete IgG anti-contabbit (HRP) em 5 ml de anticorpo secundário e enxaguado quatro vezes. A detecção e o desenvolvimento dos filmes de imunotransferência foram realizados em uma sala escura, com analitos visualizados como bandas escuras nos filmes. Os filmes foram subsequentemente digitalizados e as intensidades da banda foram quantificadas usando o scanner de densitômetro de imagem GS-700 e o programa Quantity One (Bio-Rad).