Apoptoosimekanismien genomiset ja proteomiset analyysit sairaan peri-implanttikudoksen yhteydessä

Tutkimus sai eettisen hyväksynnän Sakaryan yliopiston lääketieteellisen tiedekunnan kliinisen tutkimuskomitean (hyväksynänumero: E-16214662-050.01.04-85,162-217), ja se tehtiin Helsingin julistuksessa esitettyjen eettisten periaatteiden mukaisesti. Tutkimusprotokolla selitettiin perusteellisesti kaikille osallistujille, ja kirjallinen tietoinen suostumus saatiin ennen niiden sisällyttämistä. Rekrytointi tapahtui maaliskuun 2021 ja kesäkuun 2022 välisenä aikana, joihin osallistui potilaat, jotka osallistuivat Sakaryan yliopiston periodontologian laitoksen klinikoille. Nämä potilaat olivat joko ylläpitovaiheessa hammasimplantehoidon jälkeen, aktiivisesti implantihoidossa tai esiintyivät muihin keskuksiin sijoitettuihin hammasimplantteihin liittyvät komplikaatiot. Tutkimukseen osallistui yhteensä 72 osallistujaa, jotka kattavat 72 hammasimplantaattia. Nämä osallistujat luokiteltiin seuraavasti: 23 systeemisesti tervettä henkilöä, joilla oli peri-implantti mukosiitti, 25 yksilöä, joilla on peri-implantiitti ja 24 terveellistä kontrollia. Haastattelujen aikana kerättiin osallistujien väestötiedot sekä lääketieteelliset ja hammashistoriat. Suoritettiin kattava koko suu-periodontaalinen tutkimus, ja seuraavat kliiniset parametrit mitattiin kuudessa paikassa kunkin implantin ympärillä käyttämällä kalibroidun manuaalisen periodontaalisen koettimen (Hu-Fried, Chicago, IL, USA): keratinisoitu limakalvon leveys (KTW), modifioitu paine-indeksi (MBI) ja modifioitu PLAQUE-indeksi (MBI) ja Moding Index (Mod) ja Moding Index), Moding Dect (Moding), Moding Index (Mod), Moding Dection (KTW). (MGI). Kaikki arvioinnit suoritti yksi kalibroitu periodontisti (DY, Kappa -kerroin: 0,92). Radiografiset arvioinnit marginaalisten alveolaaristen luujen tasoista ja luun menetysprosenteista suoritettiin ImageJ -ohjelmistolla (ImageJ, Wisconsin, USA). Perimipintin kudoksen terveys luokiteltiin periodontaalisten ja peri-implanttitautien luokituksen vuoden 2017 luokituksen mukaisesti.

Kliiniset toimenpiteet ja kudosnäytteet lähtötason arviointien jälkeen kaikille osallistujille tehtiin täysisuusta ennaltaehkäisy ja suuhygieniamotivaatio, kuten EFP-hoito-ohjeet suosittelivat. Potilaat, joilla oli diagnosoitu peri-implantti mukosiitti tai peri-implantiitti, hoidettiin yhdellä parodontistilla (DY). Rakeistuksen kudosnäytteet kerättiin peri-implantin mukosiitin (ei-kirurgisen) ja peri-implantiitin (resektiivisen, rekonstruktiivisen tai yhdistetyn kirurgisen lähestymistavan) hoidon aikana. Kaikki rakeistus- ja limakalvokudosnäytteet laitettiin heti Eppendorf -putkiin ja varastoitiin -80 ° C: seen. Myöhemmin näytteet kuljetettiin hammaslääketieteen instituuttiin, Turkun yliopistoon ja Helsingin yliopistosairaalaan, Helsingin yliopistoon, kuivissa jääolosuhteissa biokemiallisissa analyyseissä. Ylläpitohoito tarjottiin kaikille potilaille, joilla oli peri-implanttitauteja, kun heidän vastaavat hoitoprotokollat ​​päättyivät.

Bcl-2-perheproteiinien analyysit sulatetut kudosnäytteet punnittiin ensin ja leikattiin myöhemmin pieniksi paloiksi, joissa oli kertakäyttöisiä skalpelejä ( #11 ja #15, Feather Safety Razor Co., Ltd, Osaka, Japani). Käsiteltyjä kudosfragmentteja siirrettiin 2 ml: n putkiin, jotka sisälsivät neljä ultrapippurista zirkoniummikrosfääriä (halkaisija 3 mm) ja 400 μl hajotuspuskuria. Homogenointi suoritettiin käyttämällä nopean kudoksen homogenoijaa (Tissuelyzer LT, Qiagen, Hilden, Saksa), joka oli asetettu 2000 rpm: iin neljään 60 sekunnin jaksoon, 20 sekunnin välein jäällä ylikuumenemisen estämiseksi. Homogenisoinnin jälkeen näytteet sentrifugoitiin nopeudella 10000 rpm 4 minuutin ajan ja zirkoniumhelmet poistettiin. Ultraääni (UP50H, Hielscher, Teltow, Saksa) suoritettiin 0,5 syklillä ja 100% amplitudilla kolmessa 5 sekunnin jaksossa, ja syklien välillä oli 20 sekunnin välein. Näytteet sentrifugoitiin sitten jälleen nopeudella 10000 rpm 4 minuutin ajan, ja supernatantit siirrettiin huolellisesti uusiin putkiin. Näytteiden kokonaisproteiinipitoisuudet mitattiin Bradford -määrityksellä. Bcl-2-perheproteiinien tasot kvantifioitiin käyttämällä helmipohjaista immunomääritysjärjestelmää (Luminex XMAP, Luminex Corporation, Austin, TX, USA) kaupallisesti saatavissa olevilla sarjoilla (Bio-Plex Pro RBM -apoptoosimääritykset, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) valmistajan ohjeiden jälkeen.

P. gingivalis gingipainin ja T. denticola dentilisiini -immunoblot -analyysien immunoblot -analyysit suoritettiin sekoittamalla näytteet huoneenlämpötilassa Laemmlin näytepuskurin kanssa ja lämmittämällä ne 100 ° C: ssa 5 minuuttia ennen elektroforeesia. Molekyylipainomarkkereina käytettiin esivärjättyjä matalan alueen molekyylipainoisia SDS-PAGE-standardeja (Bio-Rad). P. gingivalikselle Gingipaini ja T. denticola dentilisiini toimivat positiivisena kontrollina. Kaikki näytteet ja markkerit ladattiin 8% SDS-PAGE-geeleihin ja elektroforeesoitiin 150 V: n nopeudella yhden tunnin ajan. Geelit siirrettiin sitten nitroselluloosakalvoille, estämään estämisliuokseen ja inkuboitiin yön yli vastaavien polyklonaalisten vasta-aineiden ja dentilisiinin vastaisten vasta-aineiden kanssa. Inkubaation jälkeen kalvot huuhdeltiin neljä kertaa tris-puskuroidulla suolaliuoksella, joka sisälsi 1% Triton X-100: ta, inkuboitiin sitten antirabbit IgG -hevosen retiisin peroksidaasin (HRP) kanssa 5 ml: n TBST: ssä sekundaarisen vasta-aineena ja huuhtelivat neljä kertaa. Immunoblot -elokuvien havaitseminen ja kehitys suoritettiin pimeässä huoneessa, ja analyyttejä visualisoitiin elokuvien tummiksi nauhoiksi. Kalvot skannattiin myöhemmin, ja kaistaintensiteetit kvantifioitiin käyttämällä GS-700-kuvantamisen densitometrin skanneria ja Määrä One-ohjelmaa (Bio-Rad).