Genomiske og proteomiske analyser av apoptosemekanismer i syke peri-implantatvev

Studien fikk etisk godkjenning fra Clinical Research Committee of Sakarya University Fakultet for medisin (godkjenningsnummer: E-16214662-050.01.04-85,162-217) og ble utført i samsvar med de etiske prinsippene som er beskrevet i erklæringen om Helsinki. Studieprotokollen ble grundig forklart for alle deltakere, og skriftlig informert samtykke ble innhentet før deres inkludering. Rekruttering fant sted mellom mars 2021 og juni 2022, og involverte pasienter som deltok på klinikkene ved Institutt for periodontologi, Sakarya University. Disse pasientene var enten i vedlikeholdsfasen etter tannimplantatbehandling, aktivt gjennomgikk implantatbehandling eller presentert med komplikasjoner relatert til tannimplantater plassert ved andre sentre. Totalt 72 deltakere, som omfattet 72 tannimplantater, ble registrert i studien. Disse deltakerne ble kategorisert som følger: 23 systemisk friske individer med peri-implantat slimhinne, 25 individer med peri-implantitt og 24 sunne kontroller. Deltakerdemografi, sammen med medisinsk og tannhistorie, ble samlet inn under intervjuer. En omfattende fullmunnperiodontal undersøkelse ble gjennomført, og følgende kliniske parametere ble målt på seks steder rundt hvert implantat ved bruk av en kalibrert manuell periodontal sonde (Hu-Friedy, Chicago, IL, USA): Keratinized Mucosa Bredth (KTW), modifisert blødning (MBI), Probing Dypth (MBI), PLD (Kerati), Kerati). Gingival Index (MGI). Alle vurderingene ble utført av en enkelt kalibrert periodontist (DY, Kappa -koeffisient: 0,92). Radiografiske evalueringer av marginale alveolære beinnivåer og bentapsprosent ble utført ved bruk av ImageJ -programvare (ImageJ, Wisconsin, USA). Peri-implantat vevshelse ble klassifisert i samsvar med 2017-klassifiseringen av periodontale og peri-implantat sykdommer.

Kliniske prosedyrer og sampling av vev etter baseline-vurderingene, alle deltakerne gjennomgikk profylakse med full munn og oral hygiene-motivasjon som anbefalt av EFP-behandlingsretningslinjen. Pasienter diagnostisert med peri-implantat slimhinne eller peri-implantitt ble behandlet av en enkelt periodontist (DY). Granulasjonsvevsprøver ble samlet under behandlingen av peri-implantat mucositis (ikke-kirurgisk) og peri-implantitt (resektive, rekonstruktive eller kombinerte kirurgiske tilnærminger). Alle granulering og slimhinnevevsprøver ble umiddelbart plassert i Eppendorf -rør og lagret ved -80 ° C. Deretter ble prøvene fraktet til Institute of Dentistry, University of Turku og Helsinki University Hospital, University of Helsinki, under tørrisforhold for biokjemiske analyser. Vedlikeholdsbehandling ble gitt til alle pasienter med peri-implantat sykdommer etter fullføring av sine respektive behandlingsprotokoller.

Analyser av Bcl-2-familieproteiner De tinede vevsprøvene ble først veid og deretter seksjonert i små biter med engangs skalpeller (nr. 11 og #15, Feather Safety Razor Co., Ltd, Osaka, Japan). De behandlede vevsfragmentene ble overført til 2 ml rør som inneholdt fire ultrapur zirkoniummikrosfærer (3 mm diameter) og 400 ul lysbuffer. Homogenisering ble utført ved bruk av en høyhastighets vevshomogenisator (Tissuelyzer LT, Qiagen, Hilden, Tyskland) satt til 2000 o / min i fire sykluser på 60 sekunder hver, med 20 sekunders intervaller på is for å forhindre overoppheting. Etter homogenisering ble prøvene sentrifugert ved 10000 o / min i 4 minutter, og zirkoniumperlene ble fjernet. Ultralydisering (UP50H, Hielscher, Telltow, Tyskland) ble utført med 0,5 syklus og 100% amplitude i tre 5-sekunders sykluser, med 20 sekunders intervaller på is mellom syklusene. Prøvene ble deretter sentrifugert igjen ved 10000 o / min i 4 minutter, og supernatantene ble overført nøye til nye rør. Total proteinkonsentrasjoner i prøvene ble målt ved Bradford -analysen. Nivåene av Bcl-2-familieproteiner ble kvantifisert ved bruk av et perlebasert immunoassay-system (Luminex XMAP, Luminex Corporation, Austin, TX, USA) med kommersielt tilgjengelige sett (Bio-Plex Pro RBM Apoptosis-analyser, Bio-Rad-laboratorier.

Immunoblot -analyser av P. gingivalis gingipain og T. denticola dentilisin -immunoblotanalyser ble utført ved å blande prøvene ved romtemperatur med Laemmlis prøvebuffer og oppvarme dem ved 100 ° C i 5 minutter før elektroforesen. Forbeiset SDS-PAGE-standarder med lav rekkevidde (Bio-Rad) ble brukt som molekylvektmarkører. For P. gingivalis, Gingipain og T. Denticola Dentilisin fungerte som positive kontroller. Alle prøver og markører ble lastet på 8% SDS-PAGE geler og elektroforesert til 150 V i en time. Gelene ble deretter overført til nitrocellulosemembraner, gjennomvåt i blokkeringsløsning og inkubert over natten med de respektive polyklonale anti-gingipain og anti-deentilisin-antistoffene. Etter inkubering ble membranene skylt fire ganger med Tris-bufret saltvann inneholdende 1% Triton X-100, deretter inkubert med antirabbit IgG-hestestoffperoksidase (HRP) i 5 ml TBST som et sekundært antistoff og skylt fire ganger. Deteksjon og utvikling av immunoblotfilmene ble fremført i et mørkt rom, med analytter visualisert som mørke band på filmene. Filmene ble deretter skannet, og båndintensiteter ble kvantifisert ved bruk av GS-700 Imaging Densitometer-skanner og Quantity One-programmet (Bio-Rad).