Genomische und proteomische Analysen von Apoptosemechanismen in erkrankten Periimplantatgewebe

Die Studie erhielt die ethische Genehmigung des klinischen Forschungsausschusses der Fakultät für Medizin der Universität Sakarya (Genehmigungsnummer: E-16214662-050.01.04-85,162-217) und wurde gemäß den in der Erklärung von Helsinki beschriebenen ethischen Grundsätzen durchgeführt. Das Studienprotokoll wurde allen Teilnehmern gründlich erklärt, und vor ihrer Aufnahme wurde eine schriftliche Einverständniserklärung eingeholt. Die Rekrutierung fand zwischen März 2021 und Juni 2022 statt, an denen Patienten, an denen die Kliniken des Ministeriums für Parodontologie der Sakarya University teilnahmen. Diese Patienten befanden sich entweder in der Erhaltungsphase nach einer Zahnimplantat -Therapie, machten sich aktiv implantiert, oder zeigten Komplikationen im Zusammenhang mit Zahnimplantaten, die in anderen Zentren platziert waren. Insgesamt 72 Teilnehmer, die 72 Zahnimplantate umfassten, wurden in die Studie aufgenommen. Diese Teilnehmer wurden wie folgt eingestuft: 23 systemisch gesunde Personen mit Periimplantatmukositis, 25 Personen mit Periimplantitis und 24 gesunde Kontrollpersonen. Die Demografie der Teilnehmer sowie medizinische und zahnärztliche Geschichten wurden während der Interviews gesammelt. A comprehensive full-mouth periodontal examination was conducted, and the following clinical parameters were measured at six sites around each implant using a calibrated manual periodontal probe (Hu-Friedy, Chicago, IL, USA): keratinized mucosa width (KTW), modified bleeding index (mBI), probing depth (PD), modified plaque index (mPI), and modified gingival index (mgi). Alle Bewertungen wurden von einem einzelnen kalibrierten Parodontologen (DY, Kappa -Koeffizient: 0,92) durchgeführt. Röntgenbewertungen von marginalen Alveolarknochenniveaus und Knochenverlustprozentsätzen wurden unter Verwendung von ImageJ -Software (ImageJ, Wisconsin, USA) durchgeführt. Periimplantatgewebegesundheit wurde gemäß der Klassifizierung von Parodontal- und Periimplantatkrankheiten von 2017 eingestuft.

Klinische Verfahren und Gewebeprobenahme Nach den Basisbewertungen wurden alle Teilnehmer eine vollständige Prophylaxe- und Mundhygiene-Motivation unterzogen, wie in der EFP-Behandlungsrichtlinie empfohlen. Patienten, bei denen Periimplantat-Mukositis oder Periimplantitis diagnostiziert wurde, wurden von einem einzelnen Parodontologen (DY) behandelt. Granulationsgewebeproben wurden während der Behandlung von Periimplantat-Mukositis (nicht-chirurgischer) und Periimplantitis (resektiv, rekonstruktiver oder kombinierter chirurgischer Ansätze) entnommen. Alle Granulations- und Schleimhautgewebeproben wurden sofort in Eppendorf -Röhrchen gegeben und bei -80 ° C gelagert. Anschließend wurden die Proben unter Trockeneisbedingungen für biochemische Analysen an das Institut für Zahnmedizin der Universität Turku und das Helsinki University Hospital der Universität Helsinki gebracht. Alle Patienten mit Periimplantatkrankheiten wurde nach Abschluss ihrer jeweiligen Behandlungsprotokolle zur Erhaltungstherapie zur Verfügung gestellt.

Analysen von Proteinen der Bcl-2-Familie Die aufgetauten Gewebeproben wurden zuerst gewogen und anschließend in kleine Stücke mit Einweg-Skalpellen ( #11 und #15, Feather Safety Razor Co., Ltd., Osaka, Japan) geschnitten. Die verarbeiteten Gewebefragmente wurden in 2 ml Röhrchen übertragen, die vier Ultrapur -Zirkonium -Mikrokugeln (3 mM Durchmesser) und 400 & mgr; l Lysepuffer enthielten. Die Homogenisierung wurde unter Verwendung eines Hochgeschwindigkeitsgewebes-Homogenisators (Tissuelyzer LT, Qiagen, Hilden, Deutschland) durchgeführt, das jeweils vier Zyklen von jeweils 60 Sekunden mit 20 Sekunden auf 2000 U / min eingestellt war, wobei 20 Sekunden Intervalle auf Eis zur Verhinderung von Überhitzung. Nach der Homogenisierung wurden die Proben 4 Minuten bei 10000 U / min zentrifugiert und die Zirkoniumperlen entfernt. Ultraschall (up50h, Hielscher, Teltow, Deutschland) wurde in drei Sekunden-Zyklen mit einem Zyklus von 0,5 und einer 100% igen Amplitude durchgeführt, wobei zwischen den Zyklen 20-Sekunden-Intervalle auf Eis. Die Proben wurden dann 4 Minuten bei 10000 U / min erneut zentrifugiert, und die Überstände wurden sorgfältig in neue Röhren übertragen. Die Gesamtproteinkonzentrationen in den Proben wurden mit dem Bradford -Assay gemessen. Die Werte der Proteine ​​der Bcl-2-Familie wurden unter Verwendung eines Perlen-basierten Immunoassay-Systems (Luminex XMAP, Luminex Corporation, Austin, TX, USA) mit kommerziell erhältlichen Kits (Bio-PLEX Pro RBM Apoptosis Assays, Bio-Rad Labors, Hercules, Ca, Ca, USA) nach den Anweisungen des Herstellers quantifiziert.

Immunoblot -Analysen von P. gingivalis Gingipain und T. denticola dentilisin -Immunoblot -Analysen wurden durchgeführt, indem die Proben bei Raumtemperatur mit Laemmli -Probenpuffer gemischt und 5 Minuten vor der Elektrophorese bei 100 ° C erhitzt wurden. Als Molekulargewichtsmarker wurden vorgefärte SDS-PAGE-Standards mit niedrigem Bereich SDS-PAGE (BIO-Rad) verwendet. Für P. gingivalis dienten Gingipain und T. Denticola Dentilisin als positive Kontrollpersonen. Alle Proben und Marker wurden auf 8% SDS-PAGE-Gele geladen und für eine Stunde bei 150 V elektrophores. Die Gele wurden dann auf Nitrocellulosemembranen übertragen, in Blockierungslösung eingeweicht und über Nacht mit den jeweiligen polyklonalen Anti-Ingingipain- und Anti-Dentilisin-Antikörpern inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Membranen viermal mit Tris-gepufferter Salzlösung mit 1% Triton X-100 gespült, dann mit Antirabbit-IgG-Pferdestichperoxidase (HRP) in 5 ml TBST als sekundärer Antikörper inkubiert und viermal gespült. Die Erkennung und Entwicklung der Immunoblot -Filme wurden in einem dunklen Raum aufgeführt, wobei Analyten als dunkle Bands auf den Filmen sichtbar gemacht wurden. Die Filme wurden anschließend gescannt, und die Bandintensitäten wurden unter Verwendung des GS-700-Bildgebungs-Densitometer-Scanners und des Bio-Rads-Programms (Bio-Rad) quantifiziert.