병든 임플란트 조직에서 아 pop 토 시스 메커니즘의 게놈 및 단백질 분석

이 연구는 Sakarya University 의과 대학 임상 연구위원회 (승인 번호 : E-1621462-050.01.04-85,162-217)의 윤리적 승인을 받았으며 Helsinki의 선언에 요약 된 윤리적 원칙에 따라 수행되었습니다. 연구 프로토콜은 모든 참가자들에게 철저히 설명되었으며, 포함 전에 서면 사전 동의를 얻었습니다. 모집은 2021 년 3 월에서 2022 년 6 월 사이에 이루어졌으며, Sakarya University 치주학과의 클리닉에 참석 한 환자들과 관련이있었습니다. 이 환자들은 치과 임플란트 요법 후 유지 보수 단계, 적극적으로 임플란트 치료를 받거나 다른 센터에 배치 된 치과 임플란트와 관련된 합병증을 나타 냈습니다. 72 개의 치과 임플란트를 포함하는 총 72 명의 참가자가 연구에 등록되었습니다. 이 참가자들은 임플란트 주변 점막염을 가진 23 명의 체계적으로 건강한 개인, 임플란트 주위염이있는 25 명, 24 개의 건강한 대조군으로 분류되었습니다. 의료 및 치과 이력과 함께 참가자 인구 통계는 인터뷰 중에 수집되었습니다. 포괄적 인 전체 입고 치주 검사가 수행되었고, 다음 임상 매개 변수는 교정 된 수동 치주 프로브 (Hu-Friedy, Chicago, IL, USA)를 사용하여 각 임플란트 주변의 6 개 부위에서 측정되었습니다. 각질 화 된 점막 폭 (KTW), 수정 된 블리징 지수 (MBI), 수정 된 PLA (PROBINIDED), MPI (MPI) 및 MPI (Probing index) 및 MPI (MPI) 및. (MGI). 모든 평가는 단일 교정 치주 연주자 (DY, 카파 계수 : 0.92)에 의해 수행되었습니다. 한계 폐포 뼈 수준 및 뼈 손실 백분율의 방사선 학적 평가는 ImageJ 소프트웨어 (ImageJ, Wisconsin, USA)를 사용하여 수행되었습니다. 임플란트 조직 건강은 2017 년 치주 및 임플란트 질병의 분류에 따라 분류되었습니다.

임상 절차 및 조직 샘플링 기준 평가 후, 모든 참가자는 EFP 치료 지침에 의해 권장되는 전체 입 예방 및 구강 위생 동기 부여를 받았습니다. 임플란트 주변 점막염 또는 임플란트 주위염으로 진단 된 환자는 단일 치주 전문가 (DY)에 의해 치료되었습니다. 과립 조직 샘플은 임플란트 점막염 (비 외과 적) 및 임플란트 주위염 (절제, 재구성 또는 결합 된 외과 적 접근)의 치료 동안 수집되었습니다. 모든 과립 화 및 점막 조직 샘플을 즉시 Eppendorf 튜브에 넣고 -80 ℃에서 보관 하였다. 그 후, 샘플은 생화학 분석을 위해 드라이 아이스 조건으로 헬싱키 대학교 헬싱키 대학교 헬싱키 대학교 병원의 치과 연구소로 이송되었습니다. 각각의 치료 프로토콜이 완료되면 임플란트 주변 질환이있는 모든 환자에게 유지 요법이 제공되었습니다.

BCL-2 패밀리 단백질의 분석 해동 조직 샘플을 먼저 무게를 측정 한 다음, 일회용 메스 ( #11 및 #15, Feather Safety Razor Co., Ltd, Japan, Japan)로 작은 조각으로 절단 하였다. 가공 된 조직 단편을 4 개의 초저 지르코늄 미소 구 (3mm 직경) 및 400 μL의 용해 완충액을 함유하는 2mL 튜브로 옮겼다. 균질화는 고속 조직 균질화 제 (Tissuelyzer LT, Qiagen, 독일 힐든)를 사용하여 2000 rpm에 각각 60 초의 4주기 동안 설정되었으며 얼음 위의 20 초 간격으로 과열을 방지했습니다. 균질화 후, 샘플을 10000 rpm에서 4 분 동안 원심 분리하고 지르코늄 비드를 제거 하였다. 초음파 화 (UP50H, Hielscher, Teltow, Germany)는 3 개의 5 초 사이클에서 0.5 사이클 및 100% 진폭으로 수행되었으며, 사이클 사이의 얼음에서 20 초 간격으로 수행되었다. 이어서, 샘플을 10000 rpm에서 4 분 동안 다시 원심 분리하고, 상청액을 새로운 튜브로 조심스럽게 옮겼다. 샘플의 총 단백질 농도는 브래드 포드 분석에 의해 측정되었다. BCL-2 패밀리 단백질의 수준은 제조업체의 지시에 따라 상용 키트 (Bio-Plex Pro RBM 아 pop 토 시스 분석, Bio-RAD Laboratories, Hercules, CA, USA)를 갖춘 비드 기반 면역 분석 시스템 (Luminex XMAP, Luminex Corporation, Luminex Corporation, Austin, USA)을 사용하여 정량화 하였다.

P. gingivalis gingipain 및 T. denticola dentilisin immunoblot 분석의 면역 블롯 분석을 실온에서 Laemmli의 샘플 완충제와 혼합하고 전기 영동 전에 5 분 동안 100 ℃에서 가열함으로써 수행되었다. 사전 염색 된 저 범위 분자량 SDS-PAGE 표준 (BIO-RAD)을 분자량 마커로 사용 하였다. P. gingivalis의 경우, Gingipain과 T. denticola dentilisin은 양성 대조군으로 사용되었습니다. 모든 샘플 및 마커를 8% SDS-PAGE 겔에 로딩하고 150V에서 1 시간 동안 전기 영동 하였다. 이어서, 겔을 니트로 셀룰로오스 막에 옮기고, 차단 용액에 담그고, 각각의 폴리 클로 날 항-징전 피 페인 및 항-데 텐틸 리신 항체와 함께 밤새 인큐베이션 하였다. 인큐베이션 후, 막을 1% 트리톤 X-100을 함유하는 트리스-완충 식염수로 4 회 헹구고, 이차 항체로서 5 mL TBST에서 항 트리트 비트 IgG 말의 퍼 옥시 다제 (HRP)와 함께 배양하고 4 회 헹굼 하였다. 면역 블롯 필름의 검출 및 발달은 어두운 방에서 수행되었으며, 분석 물은 필름에서 어두운 밴드로 시각화되었습니다. 이어서 필름을 스캔하고 GS-700 이미징 밀도계 스캐너 및 수량 1 프로그램 (Bio-RAD)을 사용하여 밴드 강도를 정량화 하였다.