Analisi genomiche e proteomiche dei meccanismi di apoptosi nel tessuto perimplantato malato

Lo studio ha ricevuto l'approvazione etica dal Comitato di ricerca clinica della Facoltà di Medicina dell'Università di Sakarya (numero di approvazione: E-16214662-050.01.04-85.162-217) ed è stato condotto in conformità con i principi etici delineati nella dichiarazione di Helsinki. Il protocollo di studio è stato completamente spiegato a tutti i partecipanti e il consenso informato scritto è stato ottenuto prima della loro inclusione. Il reclutamento ebbe luogo tra marzo 2021 e giugno 2022, coinvolgendo i pazienti che frequentavano le cliniche del Dipartimento di Nationalontologia, Università di Sakarya. Questi pazienti erano o in fase di mantenimento in seguito alla terapia dell'impianto dentale, sottoposti attivamente al trattamento con impianti o presentavano complicanze correlate agli impianti dentali posti in altri centri. Un totale di 72 partecipanti, che comprendono 72 impianti dentali, sono stati iscritti allo studio. Questi partecipanti sono stati classificati come segue: 23 individui sistematicamente sani con mucosite perimplant, 25 individui con perimplantite e 24 controlli sani. I dati demografici dei partecipanti, insieme a storie mediche e dentali, sono stati raccolti durante le interviste. È stato condotto un esame parodontale completo completo e i seguenti parametri clinici sono stati misurati in sei siti attorno a ciascun impianto usando una sonda parodontale manuale calibrata (Hu-Fededy, Chicago, IL, USA): Larghezza Micosa cheratinizzata (MPIAD GEDIFICATIE (MPIAZIONE GEDIFICATO (MPIAZIONE GEDIFICA (MGI). Tutte le valutazioni sono state eseguite da un singolo parodontista calibrato (DY, coefficiente di kappa: 0,92). Le valutazioni radiografiche dei livelli ossei alveolari marginali e delle percentuali di perdita ossea sono state condotte utilizzando il software ImageJ (ImageJ, Wisconsin, USA). La salute del tessuto perimplantato è stata classificata in conformità con la classificazione del 2017 di malattie parodontali e perimplantato.

Procedure cliniche e campionamento dei tessuti A seguito delle valutazioni di base, tutti i partecipanti hanno subito la profilassi a bocca intera e la motivazione dell'igiene orale come raccomandato dalle linee guida per il trattamento EFP. I pazienti con diagnosi di mucosite perimpianto o perimplantite sono stati trattati da un singolo parodontista (DY). I campioni di tessuto di granulazione sono stati raccolti durante il trattamento della mucosite perimpianto (non chirurgica) e della perimplantite (approcci chirurgici resettivi, ricostruttivi o combinati). Tutti i campioni di granulazione e tessuto della mucosa sono stati immediatamente posizionati in tubi Eppendorf e conservati a -80 ° C. Successivamente, i campioni sono stati trasportati all'Institute of Dentistry, University of Turku e Helsinki University Hospital, Università di Helsinki, in condizioni di ghiaccio secco per analisi biochimiche. La terapia di mantenimento è stata fornita a tutti i pazienti con malattie per-impianti al completamento dei rispettivi protocolli di trattamento.

Analisi delle proteine ​​della famiglia Bcl-2 I campioni di tessuto scongelato sono stati prima pesati e successivamente sezionati in piccoli pezzi con bisturi usa e getta (n. 11 e n. 15, Feather Safety Razor Co., Ltd, Osaka, Giappone). I frammenti di tessuto trasformati sono stati trasferiti a 2 ml di tubi contenenti quattro microsfere di zirconio ultrapure (diametro 3 mm) e 400 μL di tampone di lisi. L'omogeneizzazione è stata eseguita utilizzando un omogeneizzatore di tessuto ad alta velocità (Tissuelyzer LT, Qiagen, Hilden, Germania) fissato a 2000 giri / min per quattro cicli di 60 secondi ciascuno, con 20 secondi intervalli sul ghiaccio per prevenire il surriscaldamento. Dopo l'omogeneizzazione, i campioni sono stati centrifugati a 10000 giri / min per 4 minuti e le perle di zirconio sono state rimosse. L'ecografia (UP50H, Hielscher, Teltow, Germania) è stata eseguita a 0,5 cicli e ampiezza al 100% in tre cicli di 5 secondi, con intervalli di 20 secondi sul ghiaccio tra i cicli. I campioni sono stati quindi centrifugati a 10000 giri / min per 4 minuti e i supernatanti sono stati attentamente trasferiti su nuovi tubi. Le concentrazioni totali di proteine ​​nei campioni sono state misurate dal test Bradford. I livelli di proteine ​​della famiglia Bcl-2 sono stati quantificati utilizzando un sistema di test immuno-saggi a base di tallone (Luminex XMAP, Luminex Corporation, Austin, TX, USA) con kit disponibili in commercio (saggi di apoptosi Bio-Plex Pro RBM, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) seguendo le istruzioni del produttore.

Le analisi di immunoblot di P. gingivalis Gingipain e T. denticola dentalisina sono state eseguite analisi di immunoblot in dentilisina e riscaldandole a 100 ° C di Laemmli e riscaldandole a 100 ° C per 5 minuti prima dell'elettroforesi. Gli standard SDS-PAGE di peso molecolare a basso raggio pre-macchiato (Bio-Rad) sono stati usati come marcatori di peso molecolare. Per P. gingivalis, Gingipain e T. denticola dentilisina sono serviti da controlli positivi. Tutti i campioni e i marcatori sono stati caricati su gel SDS-PAGE all'8% e elettroforizzati a 150 V per un'ora. I gel sono stati quindi trasferiti su membrane di nitrocellulosa, imbevuti in soluzione di blocco e incubati durante la notte con i rispettivi anticorpi policlonali anti-penipain e anti-dententilisina. Dopo l'incubazione, le membrane sono state sciacquate quattro volte con soluzione salina tamponata con Tris contenente l'1% di Triton X-100, quindi incubate con perossidasi di ravanello IgG antirabbit (HRP) in 5 ml di anticorpo secondario e sciacquato quattro volte. Il rilevamento e lo sviluppo dei film di immunoblot sono stati eseguiti in una stanza buia, con analiti visualizzati come bande scure nei film. I film sono stati successivamente scansionati e le intensità di banda sono state quantificate utilizzando lo scanner del densitometro di imaging GS-700 e il programma di quantità uno (Bio-Rad).