Genomické a proteomické analýzy mechanismů apoptózy v nemocné periounské tkáni

Studie obdržela etický schválení od Clinical Research Committee na univerzitě v Sakarya University (schválení číslo: E-16214662-050.01.04-85,162-217) a byl proveden v souladu s etickými zásadami uvedenými v prohlášení Helsinki. Protokol studie byl důkladně vysvětlen všem účastníkům a před začleněním byl získán písemný informovaný souhlas. Nábor se konal mezi březnem 2021 a červnem 2022, zahrnující pacienty, kteří navštěvovali kliniky ministerstva periodontologie, Sakarya University. Tito pacienti byli buď ve fázi údržby po terapii dentálních implantátů, aktivně podstoupili léčbu implantátu, nebo se projevili komplikacemi souvisejícími s zubními implantáty umístěnými v jiných centrech. Do studie bylo zapsáno celkem 72 účastníků, které zahrnují 72 dentálních implantátů. Tito účastníci byli kategorizováni takto: 23 systémově zdravých jedinců s mukozitidou s pei-implantátem, 25 jedinců s perimplantitidou a 24 zdravých kontrol. Během rozhovorů byla shromážděna demografie účastníků spolu s lékařskými a zubními historiemi. Bylo provedeno komplexní periodontální vyšetření s plným územím a následující klinické parametry byly měřeny na šesti místech kolem každého implantátu pomocí kalibrované manuální periodontální sondy (Hu-Friedy, Chicago, IL, USA): keratizovaná sliznice (KTW), modifikované krvácení (MBI), modifikované index (MPI) a modifikované) a modifikované) a modifikované) a modifikované) a modifikované) a modifikované) a modifikované) a modifikované) a modifikované) a modifikované) a modifikované) a modifikované index (MBI) a modifikované) a modifikované index (MBI) (MBI), modifikované platnosti (KTW), modifikované index (MBI) (MBI), modifikovaná platnost (KTW) (MPI), modifikovaná. Gingivální index (MGI). Všechna hodnocení byla provedena jediným kalibrovaným periodontistou (Dy, Kappa Coeficient: 0,92). Radiografická hodnocení mezních hladin alveolární kosti a procenta ztráty kosti byla prováděna pomocí softwaru ImageJ (ImageJ, Wisconsin, USA). Zdraví tkáně pei-implantátu bylo klasifikováno v souladu s klasifikací periodontálních a peimplantátních chorob v roce 2017.

Klinické postupy a odběr vzorků tkání Po základních hodnoceních podstoupili všichni účastníci profylaxi a motivaci ústní hygieny v plné úst, jak je doporučeno v pokynu EFP. Pacienti s diagnózou peimimplantátní mukozitidy nebo peiimplantitidy byli léčeni jediným parodontistou (DY). Vzorky granulační tkáně byly odebrány během léčby mukozitidy pei-implantátu (nechirurgická) a pei-implantitida (resektivní, rekonstrukční nebo kombinované chirurgické přístupy). Všechny vzorky granulace a slizniční tkáně byly okamžitě umístěny do zkumavek Eppendorf a uloženy při -80 ° C. Následně byly vzorky přepraveny do institutu stomatologie, University of Turku a Helsinki University Hospital, University of Helsinki, za suchých ledových podmínek pro biochemické analýzy. Po dokončení jejich příslušných léčebných protokolů byla poskytnuta udržovací terapie všem pacientům s pei-implantačními chorobami.

Analýzy rodinných proteinů Bcl-2 Výřečky tkáně rozmrazených tkáně byly poprvé zváženy a následně rozděleny do malých kusů s jednorázovými skalpely ( #11 a #15, Feather Safety Razor Co., Ltd, Osaka, Japonsko). Zpracované fragmenty tkáně byly přeneseny do 2 ml zkumavek obsahujících čtyři ultrapurové mikrosfáry zirkonia (průměr 3 mm) a 400 ul lýzního pufru. Homogenizace byla prováděna s použitím vysokorychlostního homogenizátoru tkáně (Tissuelyzer LT, Qiagen, Hilden, Německo) nastaveno na 2000 ot / min pro čtyři cykly po 60 sekundách, přičemž 20 sekundy na ledu, aby se zabránilo přehřátí. Po homogenizaci byly vzorky odstředěny při 10000 ot / min po dobu 4 minut a zirkoniové kuličky byly odstraněny. Ultrazvuk (UP50H, Hielscher, Teltow, Německo) byla provedena při 0,5 cyklu a 100% amplituda ve třech 5sekundových cyklech, s 20 sekundovým intervalem na ledu mezi cykly. Vzorky byly poté odstředěny znovu při 10000 ot / min po dobu 4 minut a supernatanty byly pečlivě přeneseny do nových zkumavek. Celkové koncentrace proteinu ve vzorcích byly měřeny Bradfordským testem. Hladiny rodinných proteinů Bcl-2 byly kvantifikovány pomocí imunoanalýzého systému na bázi kuliček (Luminex XMAP, Luminex Corporation, Austin, TX, USA) s komerčně dostupnými soupravami (Bio-Plex Pro RBM apoptózová testy, Bio-Rad Laboratories, Hercules, USA).

Imunoblotové analýzy imunoblotových analýz P. gingivalis gingipain a T. denticola dentilisin byly provedeny smícháním vzorků při teplotě místnosti pomocí Laemmliho vzorkovacího pufru a jejich zahříváním při 100 ° C po dobu 5 minut před elektroforézou. Jako markery molekulové hmotnosti byly použity předem obarvené standardy molekulové hmotnosti nízkého rozsahu SDS-PAGE (Bio-Rad). Pro P. gingivalis sloužily jako pozitivní kontroly gingipain a T. denticola dentilisin. Všechny vzorky a markery byly naloženy na 8% SDS-PAGE gely a elektroforézovány při 150 V po dobu jedné hodiny. Gely byly poté přeneseny na nitrocelulózové membrány, namočeny v blokovacím roztoku a inkubovány přes noc s příslušnými polyklonálními anti-ggipain a anti-dentilisinovými protilátkami. Po inkubaci byly membrány čtyřikrát propláchnuty fyziologickým roztokem s Tris obsahujícím 1% Triton X-100, poté inkubovány s antirabbitskou IgG koňskou ředcidázou (HRP) v 5 ml TBST jako sekundární protilátku a čtyřikrát propláchnuty. Detekce a vývoj imunoblotových filmů byly provedeny v temné místnosti, přičemž analyty vizualizovaly jako tmavé pásy na filmech. Filmy byly následně naskenovány a intenzity pásma byly kvantifikovány pomocí zobrazovacího denního skeneru GS-700 a programu Quantent One (Bio-Rad).