Analyses génomiques et protéomiques des mécanismes d'apoptose dans le tissu péri-implantant malade

L'étude a reçu l'approbation éthique du comité de recherche clinique de la Faculté de médecine de l'Université de Sakarya (numéro d'approbation: E-16214662-050.01.04-85,162-217) et a été menée conformément aux principes éthiques décrits dans la déclaration d'Helsinki. Le protocole d'étude a été entièrement expliqué à tous les participants, et un consentement éclairé écrit a été obtenu avant leur inclusion. Le recrutement a eu lieu entre mars 2021 et juin 2022, impliquant des patients qui ont assisté aux cliniques du Département de parodontologie de l'Université Sakarya. Ces patients étaient soit en phase d'entretien après un traitement d'implant dentaire, subissant un traitement implantaire activement, soit présentant des complications liées aux implants dentaires placés dans d'autres centres. Au total, 72 participants, englobant 72 implants dentaires, ont été inscrits à l'étude. Ces participants ont été classés comme suit: 23 individus systémiquement en bonne santé atteints de mucite péri-implantaire, 25 personnes atteintes de péri-implantite et 24 témoins sains. Les données démographiques des participants, ainsi que des antécédents médicaux et dentaires, ont été collectées lors des entretiens. Un examen parodontal complet de la bouche complète a été effectué, et les paramètres cliniques suivants ont été mesurés sur six sites autour de chaque implantation à l'aide d'une sonde parodontale manuelle calibrée (Hu-Friedy, Chicago, IL, USA): Width MuCosa kératinisée (KTW), indice de saignement modifié (MBI), Profoncement de sond Index (MGI). Toutes les évaluations ont été effectuées par un parodontiste calibré unique (DY, coefficient Kappa: 0,92). Des évaluations radiographiques des niveaux d'os alvéolaires marginaux et des pourcentages de perte osseuse ont été effectués à l'aide du logiciel ImageJ (ImageJ, Wisconsin, USA). La santé des tissus péri-implantaires a été classé conformément à la classification 2017 des maladies parodontales et péri-implantaires.

Procédures cliniques et échantillonnage des tissus Après les évaluations de référence, tous les participants ont subi une prophylaxie de la bouche complète et une motivation de l'hygiène buccale comme recommandé par les directives de traitement de l'EFP. Les patients diagnostiqués avec une mucite péri-implantaire ou une péri-implantite ont été traités par un parodontiste unique (DY). Des échantillons de tissus de granulation ont été prélevés lors du traitement de la mucite péri-implantaire (non chirurgicale) et de la péri-implantite (approches chirurgicales résective, reconstructive ou combinée). Tous les échantillons de granulation et de tissu muqueux ont été immédiatement placés dans des tubes Eppendorf et stockés à -80 ° C. Par la suite, les échantillons ont été transportés à l'Institut de dentisterie de l'Université de Turku et de l'hôpital universitaire d'Helsinki de l'Université d'Helsinki, dans des conditions de glace sèche pour les analyses biochimiques. Un traitement d'entretien a été fourni à tous les patients atteints de maladies péri-implantaires à la fin de leurs protocoles de traitement respectifs.

Analyses des protéines de la famille Bcl-2 Les échantillons de tissus décongelés ont d'abord été pesés et sectionnés par la suite en petits morceaux avec des scalpels jetables (# 11 et # 15, Feather Safety Razor Co., Ltd, Osaka, Japon). Les fragments de tissus traités ont été transférés dans des tubes de 2 ml contenant quatre microsphères de zirconium ultrapure (3 mm de diamètre) et 400 μl de tampon de lyse. L'homogénéisation a été réalisée en utilisant un homogénéisateur tissulaire à grande vitesse (Tissueelyzer LT, Qiagen, Hilden, Allemagne) fixé à 2000 tr / min pendant quatre cycles de 60 secondes chacun, avec 20 secondes d'intervalle sur la glace pour éviter la surchauffe. Après homogénéisation, les échantillons ont été centrifugés à 10000 tr / min pendant 4 minutes et les billes de zirconium ont été retirées. L'ultrasonication (UP50H, Hielscher, Teltow, Allemagne) a été réalisée à 0,5 cycle et 100% d'amplitude en trois cycles de 5 secondes, avec des intervalles de 20 secondes sur la glace entre les cycles. Les échantillons ont ensuite été centrifugés à nouveau à 10000 tr / min pendant 4 minutes, et les surnageants ont été soigneusement transférés dans de nouveaux tubes. Les concentrations totales de protéines dans les échantillons ont été mesurées par le test Bradford. Les niveaux de protéines de la famille Bcl-2 ont été quantifiés à l'aide d'un système d'immunoessai à base de billes (Luminex XMAP, Luminex Corporation, Austin, TX, USA) avec des kits disponibles dans le commerce (Bio-Plex Pro RBM Apoptosis Assays, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) après les instructions du fabricant.

Des analyses immunoblots de P. gingivalis gingipain et T. denticola dentilisin des analyses d'immunoblot ont été effectuées en mélangeant les échantillons à température ambiante avec le tampon d'échantillon de Laemmli et en les chauffant à 100 ° C pendant 5 minutes avant l'électrophorèse. Les normes SDS-PAGE de poids moléculaire à faible gamme pré-colorées (Bio-Rad) ont été utilisées comme marqueurs de poids moléculaire. Pour P. gingivalis, Gingipain et T. denticola dentilisin ont servi de témoins positifs. Tous les échantillons et marqueurs ont été chargés sur des gels SDS-PAGE à 8% et électrophorètés à 150 V pendant une heure. Les gels ont ensuite été transférés sur des membranes de nitrocellulose, trempés dans une solution de blocage, et incubés pendant la nuit avec les anticorps polyclonaux anti-gingipains et anti-dentilisine respectifs. Après l'incubation, les membranes ont été rincées quatre fois avec une solution saline tamponnée au Tris contenant 1% de Triton X-100, puis incubé avec du radis à cheval d'IgG antivirabbit (HRP) dans 5 ml de TBST comme anticorps secondaire et rincé quatre fois. La détection et le développement des films immunoblots ont été réalisés dans une pièce sombre, avec des analytes visualisés comme des groupes sombres sur les films. Les films ont ensuite été numérisés et les intensités de la bande ont été quantifiées en utilisant le scanner de densitomètre d'imagerie GS-700 et le programme de quantité One (Bio-Rad).