NASHおよびウイルス関連のHCC患者の肝臓浸潤免疫細胞の単一細胞プロファイリング：免疫療法への影響 (1003rcr2022_72)

TMEには、免疫細胞のいくつかの集団が浸透しており、その中でエフェクターの細胞毒性TおよびNK細胞は腫瘍免疫監視を媒介します。 対照的に、CD4+調節T細胞および腫瘍関連骨髄性細胞およびマクロファージを含む阻害亜集団は、免疫応答に対抗し、腫瘍の成長を支持する可能性があります。 一部の研究では、病因に関係なく、HCCのTMEの組成を最近解読しました。

MASLおよびウイルス関連のHCCに関連する浸潤性免疫細胞の違いを明らかにするために、次を提案します。

1. 患者の登録、サンプル収集、加工、バイオバンキング。
2. SCRNA-seqによるMASLDおよびウイルス関連HCCの非腫瘍肝臓および腫瘍浸潤免疫細胞の分析。
3. 抗腫瘍細胞毒性NKおよびT細胞機能を解き放つために、本研究で特定された新たに発見された病因関連の免疫メカニズムへの介入。

この研究の主要な資産の1つは、慢性HBVおよびHCV感染症、およびMASLDの患者で構成されるHCCの以前に収集された肝臓切除から得られた凍結保存外科標本の利用可能性です。 浸潤単核細胞は、90％胎児の子牛血清/DMSOで凍結保存されています。 これは、適切に特徴付けられた患者から生物学的材料の即時利用可能性を提供し、研究全体で募集されるその後の将来のコホートで検証されるトレーニングセットとして機能します。 この目的のために、内部および外部の協力的な外科ユニットは、慢性B型肝炎またはCウイルス感染症と20人のMASLD関連HCCを研究時に治療していない20人のMASLD関連HCC患者を収集する予定です。 完全な臨床データは、専用のデータベースで収集されます。 末梢血単核細胞（PBMC）は、Ficoll-Paque Gradientと凍結保存によって得られます。 血清は全血から分離され、-80°Cで保存されます。 患者に由来するPBMCおよび血清は、バイオバンキングのために収集されます。 外科的に切除された腫瘍標本と一致した非隣接した非腫瘍組織は、紳士解離剤によるヒト腫瘍解離キットと機械的かつ酵素的に解離し、肝臓および腫瘍炎症の単核細胞を分離します（それぞれLIMおよびTIM）。 各患者の腫瘍組織から短期2D培養が確立されます。

どの細胞サブセットと経路がMASLDまたはウイルス関連のHCCに関連するかを調査するために、SCRNA-seqテクノロジーを利用して、同じタイプの細胞間の細胞型またはトランスクリプトームの不均一性の遺伝子発現の違いに関する詳細な見解を提供します。 CD45+ LIMとTIMのScrna-seqを実行します。 この目的のために、フローサイトメトリーセルのソートにより、LIMとTIMからCD45+細胞を分離します。 単一のセルからライブラリを準備するために、マイクロウェルベースのBD Rhapsodyプラットフォームを使用します。 次に、トランスクリプトーム全体のシーケンスがイルミナシーケンスプラットフォームで実行されます。 MASLDおよびウイルス関連のHCCに対して、4〜6人の患者のシーケンスを実行する予定です。 SEQGEQ™デスクトップバイオインフォマティクスプラットフォームを使用して、SCRNA-seqデータを分析して、非常に多様な遺伝子を検出し、PCA、グラフベースのクラスタリング、およびT-SNEを実行します。 目標は、HCCに由来するLIMとTIMの転写プロファイルを異なる病因と比較し、同じ患者のLIMとTIMを比較することです。 微分遺伝子発現解析は、log-scaled fold変化≥1.5およびp値<0.05で実施されます。 2つの細胞グループ間の遺伝子シグネチャ発現の比較は、対応のない2尾のウィルコクソンランクサム検定を使用して実行されます。 単一細胞のトランスクリプトミックは一般に膨大な量の情報を提供するため、細胞毒性応答と細胞毒性顆粒の放出に関連する代謝状態に関与する遺伝子に最初に特別な注意が払われ、活性化および阻害受容体のエンコード、および免疫抑制/活性微小分子をコードします。

このアプローチは、LIMとTIMの細胞サブセットの定義と、どの経路がMASLDおよびウイルス関連HCCのTMEを定義するかを定義する必要があります。 NKやT細胞などの免疫監視に任命された細胞サブセット、および腫瘍認識に関与するリガンド活性化受容体軸に特に注意が払われます。

重要な病因関連の免疫メカニズムのパネルが特定されると、より大きなコホートの発見を検証することが重要になります。

i）データは、より多くの患者で検証されます。つまり、リアルタイムPCRによる遺伝子発現を測定し、フローサイトメトリーによる免疫浸潤を分析します。 ii）LIMとTIMが、選択された経路に干渉する分子および/またはmAbsの存在下で自己一次HCC細胞と共培養されるin vitro実験を行います。 実験データ、バイオインフォマティック分析、および文献の広範な改訂の組み合わせは、私たちの目的に使用される最高の麻薬可能な場所を特定するために重要です。 たとえば、mAbsは免疫抑制分子を傍受してその効果を廃止するか、活性化経路を刺激するか、あるいは阻害受容体をブロックするために使用されます。 NKおよびT細胞機能を評価するために、細胞毒性顆粒と細胞毒性細胞から放出された細胞毒性顆粒とサイトカインを測定するフローサイトメトリーと同様に、遺伝子発現分析とフローサイトメトリーが使用されます。