Profilowanie pojedynczych komórek komórek odpornościowych infiltrujących wątrobę pacjentów z HCC związanym z NASH i wirusem: implikacje dla immunoterapii (1003rcr2022_72)

TME jest infiltrowany przez kilka populacji komórek odpornościowych, wśród których efektorowe cytotoksyczne komórki T i NK pośredniczą w immuno-obrzydzeniu guza. Natomiast subpopulacje hamujące, w tym regulacyjne komórki T CD4+ oraz komórki szpikowe i makrofagi związane z nowotworami, mogą przeciwdziałać odpowiedzi immunologicznym i sprzyjać wzrostowi guza. Niektóre badania niedawno rozszyfrowały skład TME w HCC niezależnie od etiologii.

Aby odsłonić różnice w infiltrujących komórkach odpornościowych związanych z HCC związanym z MASL i wirusem, proponujemy:

1. Rejestracja pacjentów, pobieranie próbek, przetwarzanie i biobanking.
2. Analiza nieanowych komórek odpornościowych infiltrujących się w wątrobie i nowotworach HCC związanych z MASLD i wirusem przez SCRNA-Seq.
3. Interwencja w nowo odkrytych mechanizmach immunologicznych związanych z etiologią zidentyfikowanymi w niniejszym badaniu w celu odblokowania/zwiększenia funkcji NK i komórek T cytotoksycznych i komórek T.

Jednym z głównych zasobów tego badania jest dostępność kriokonserwowanych próbek chirurgicznych uzyskanych z wcześniej zebranych resekcji wątroby dla HCC, składających się z pacjentów z przewlekłymi infekcjami HBV i HCV, a także MASLD. Infiltrujące jednojądrzaste komórki są krioprzewodowe żyjące w 90% płodowej surowicy cielęcej/DMSO. Zapewni to natychmiastową dostępność materiału biologicznego od dobrze scharakteryzowanych pacjentów i będzie służyć jako zestaw szkoleniowy, który zostanie zatwierdzony w kolejnej prospektywnej grupie, która zostanie rekrutowana podczas całego badania. W tym celu wewnętrzne i zewnętrzne jednostki chirurgiczne planują zebrać około 20 pacjentów związanych z wirusem HCC z przewlekłym zakażeniem wirusem wirusa zapalenia wątroby typu B lub C oraz 20 związanych z MASLD HCC w momencie badania. Pełne dane kliniczne zostaną zebrane w dedykowanej bazie danych. Komórki jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC) zostaną uzyskane za pomocą gradientu Ficoll-Paque i kriokochodnego. Surowica zostanie oddzielona od pełnej krwi i zachowana w -80 ° C. PBMC i surowica pochodzące od pacjentów zostaną zebrane do biobankingu. Chirurgicznie wycięte próbki nowotworu i dopasowane nie sąsiednią nieanową tkankę będą mechanicznie i enzymatycznie zdysocjowane z zestawem do dysocjacji nowotworów przez dżentelmacki dysocjacy w celu oddzielenia jednojądrzastych komórek nowotworowych (odpowiednio LIM i TIM). Krótkoterminowa hodowla 2D zostanie ustalona z tkanki nowotworowej każdego pacjenta.

Aby zbadać, które podgrupy komórkowe i ścieżki są powiązane z HCC związanym z MASLD lub wirusem, skorzystamy z technologii SCRNA-Seq, która zapewnia szczegółowy pogląd na różnice w ekspresji genów między typami komórek lub heterogeniczności transkryptomu między komórkami tego samego typu. Wykonamy seq SCRNA CD45+ Lim i Tim. W tym celu wyizolujemy komórki CD45+ od LIM i TIM za pomocą sortowania komórek cytometrii przepływowej. Aby przygotować biblioteki z pojedynczych komórek, użyjemy platformy BD Rhapsody opartej na Micro-Well. Następnie sekwencjonowanie całego transkryptomu zostanie wykonane na platformie sekwencjonowania Illumina. Planujemy wykonać sekwencjonowanie od 4 do 6 pacjentów dla HCC związanego z Masld i wirusem. Platforma bioinformatyczna SEQGEQ ™ zostanie wykorzystana do analizy danych SCRNA-Seq do wykrywania bardzo zmiennych genów, wykonywania PCA, klastrowania opartego na wykresach i T-SNE. Celem będzie porównanie profili transkrypcyjnych LIM i TIM pochodzących z HCC z różną etiologią, a także porównanie Lim i Tim tego samego pacjenta. Różnicowa analiza ekspresji genów zostanie przeprowadzona ze zmianą krotki z rozkładem logarytmicznym ≥1,5 i wartości p <0,05. Porównanie ekspresji sygnatury genowej między dwiema grupami komórek zostanie przeprowadzone przy użyciu niesparowanych dwustronnych testów suma rankingu Wilcoxona. Ponieważ transkryptomika jednokomórkowa ogólnie zapewnia ogromną ilość informacji, początkowo zwróci się szczególną uwagę na geny zaangażowane w status metaboliczny, związane z odpowiedziami cytotoksycznymi i uwalnianiem granulek cytotoksycznych, kodowanie receptorów aktywacyjnych i hamujących oraz do cząsteczek immunosupresyjnych/aktywacyjnych.

Takie podejście powinno prowadzić do definicji, w której komórkowe podzbiory Lim i Tim i które ścieżki definiują TME HCC związanego z masldem i wirusem. Szczególną uwagę zwróci się na podzbiór komórkowy zastępowany nadzorem immunologicznym, takim jak komórki NK i T oraz na osi receptora aktywujących ligand zaangażowane w rozpoznawanie nowotworu.

Po zidentyfikowaniu panelu kluczowych mechanizmów immunologicznych związanych z etiologią, ważne będzie i) walidacja wyników w większej kohorcie i II) w celu ukierunkowania najbardziej obiecujących nowo odkrytych szlaków przywrócenia działań przeciwnowotworowych cytotoksycznych NK i Funkcje komórek T.

i) Dane zostaną zatwierdzone na większej liczbie pacjentów, tj. Mierzenie ekspresji genów za pomocą PCR w czasie rzeczywistym i analizowanie infiltracji immunologicznej za pomocą cytometrii przepływowej. ii) Przeprowadzimy eksperymenty in vitro, w których Lim i Tim zostaną współkulnowani z autologicznymi pierwotnymi komórkami HCC w obecności cząsteczek i/lub mAb, które zakłócają wybrane szlaki. Połączenie danych eksperymentalnych, analizy bioinformatycznej i obszernej rewizji literatury będzie miała kluczowe znaczenie dla zidentyfikowania najlepszego miejsca, które można wykorzystać do użytku w naszym celu. Na przykład MAB zostaną wykorzystane do przechwytywania cząsteczek immunosupresyjnych i zniesienia ich działania lub do stymulowania szlaków aktywujących lub, alternatywnie do blokowania receptorów hamujących. Analiza ekspresji genów, a także cytometria przepływowa, pomiar ganulek cytotoksycznych i cytokin uwalnianych z komórek cytotoksycznych, zostaną zastosowane do oceny funkcji NK i T.