Perfil de células individuales de células inmunes infiltrantes de hígado de pacientes con CHC relacionado con NASH y virus: implicaciones para la inmunoterapia (1003rcr2022_72)

El TME está infiltrado por varias poblaciones de células inmunes, entre las cuales las células T y NK citotóxicas efectores median la inmunveilancia tumoral. Por el contrario, las subpoblaciones inhibitorias, incluidas las células T reguladoras de CD4+ y las células mieloides y los macrófagos asociados a tumores, pueden contrarrestar las respuestas inmunes y favorecer el crecimiento tumoral. Algunos estudios han descifrado recientemente la composición del TME en el CHC independientemente de la etiología.

Para revelar diferencias en las células inmunes infiltrantes asociadas con el CHC relacionado con MASL y virus, proponemos lo siguiente:

1. Inscripción del paciente, recolección de muestras, procesamiento y biobanque.
2. Análisis de células inmunes infiltrantes de hígado y tumor no tumoral de HCC relacionada con el MASLD y el virus por SCRNA-seq.
3. La intervención en mecanismos inmunes asociados a etiología recientemente descubiertos identificados en el presente estudio para desbloquear/aumentar las funciones citotóxicas nk y las células T antitumorales.

Un activo importante para este estudio es la disponibilidad de muestras quirúrgicas criopreservadas obtenidas de resecciones hepáticas recolectadas previamente para CHC, que consisten en pacientes con VHB crónicas y infecciones por VHC, así como MASLD. Las células mononucleares infiltrantes se criopreservan viviendo en suero/DMSO de terneros fetales al 90%. Esto proporcionará una disponibilidad inmediata de material biológico de pacientes bien caracterizados y servirá como un conjunto de capacitación que se validará en una cohorte prospectiva posterior que será reclutada durante todo el estudio. Con este fin, las unidades quirúrgicas colaboradoras internas y externas planean recolectar aproximadamente 20 pacientes con CHC relacionados con el virus con infección crónica por el virus de la hepatitis B o C y 20 HCC relacionados con MASLD no tratados en el momento del estudio. Los datos clínicos completos se recopilarán en una base de datos dedicada. Las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) se obtendrán mediante gradiente de ficoll-paque y criopreservado. El suero se separará de la sangre completa y se conservará a -80 ° C. PBMC y suero derivados de pacientes serán recolectados para biobancar. Las muestras tumorales resecadas quirúrgicamente y el tejido no tumoral no adyacente emparejado se disociarán mecánica y enzimáticamente con el kit de disociación tumoral humana por el disociador Gentlemacs para separar las células mononucleares infiltradas en hígado y tumor (Lim y Tim respectivamente). El cultivo 2D a corto plazo se establecerá a partir del tejido tumoral de cada paciente.

Para investigar qué subconjuntos y vías celulares están asociados con el CHC relacionado con el Virus o el virus, aprovecharemos la tecnología SCRNA-Seq que proporciona una visión detallada de las diferencias en la expresión génica entre los tipos de células o la heterogeneidad del transcriptoma en las células del mismo tipo. Realizaremos SCRNA-seq de CD45+ LIM y Tim. Con este fin, aislaremos las células CD45+ de LIM y TIM por clasificación de células de citometría de flujo. Para preparar bibliotecas de células individuales, utilizaremos la plataforma BD Rhapsody basada en Microwell. A continuación, la secuenciación de todo el transcriptoma se realizará en una plataforma de secuenciación de Illumina. Estamos planeando realizar secuenciación de 4 a 6 pacientes para el CHC relacionado con el Virus y el virus. La plataforma de bioinformática SEQGEQ ™ de escritorio se utilizará para analizar los datos de SCRNA-seq para detectar genes altamente variables, realizar PCA, agrupación basada en gráficos y T-SNE. El objetivo será comparar los perfiles transcripcionales de LIM y Tim derivados de HCC con una etiología diferente, así como comparar LIM y Tim del mismo paciente. El análisis de expresión génica diferencial se realizará con un cambio de pliegue a escala logarítmica ≥1.5 y valor P <0.05. La comparación de la expresión de la firma de genes entre dos grupos de células se realizará utilizando pruebas de suma de rango Wilcoxon de dos colas no apareadas. Dado que la transcriptómica de células unicelas generalmente proporciona una cantidad masiva de información, se prestará inicialmente una atención especial a los genes involucrados en el estado metabólico, asociado con las respuestas citotóxicas y la liberación de gránulos citotóxicos, que codifican receptores activadores e inhibidores y para moléculas inmunosupresoras/activatorias.

Este enfoque debería conducir a la definición de qué subconjuntos celulares de LIM y Tim y qué vías definen el TME del CHC relacionado con el Virus y el virus. Se prestará especial atención a los subconjuntos celulares Diputados a la vigilancia inmune, como las células NK y T y en los ejes receptores activadores de ligando involucrados en el reconocimiento tumoral.

Una vez que se identificará un panel de mecanismos inmunes asociados a la etiología clave, será importante i) validar los hallazgos en una cohorte más grande y ii) para apuntar a las vías recién descubiertas más prometedoras para restaurar las funciones citotóxicas citotóxicas antitumorales.

i) Los datos se validará en un mayor número de pacientes, es decir, medir la expresión génica por PCR en tiempo real y analizar el infiltrado inmune por citometría de flujo. ii) Realizaremos experimentos in vitro en los que Lim y Tim serán cocultivados con células de CHC primarias autólogas en presencia de moléculas y/o mAbs que interfieren en las vías seleccionadas. Una combinación de datos experimentales, análisis bioinformático y una revisión extensa de la literatura serán cruciales para identificar el mejor punto de farmacle que se utilizará para nuestro propósito. Por ejemplo, los MAB se utilizarán para interceptar moléculas inmunosupresoras y anular su efecto, o para estimular las vías activadoras, o, alternativamente, para bloquear los receptores inhibitorios. El análisis de la expresión génica, así como la citometría de flujo, que miden los gránulos citotóxicos y las citocinas liberadas de las células citotóxicas, se emplearán para evaluar la función NK y las células T.