Encelleprofilering av leverinfiltrerende immunceller hos pasienter med Nash- og virusrelatert HCC: implikasjoner for immunterapi (1003rcr2022_72)

TME infiltreres av flere populasjoner av immunceller, hvorav effektor cytotoksiske T- og NK-celler formidler tumorimmunovervåking. Derimot kan hemmende underpopulasjoner, inkludert CD4+ regulatoriske T-celler og tumorassosierte myeloide celler og makrofager, motvirke immunrespons og favorisere tumorvekst. Noen studier har nylig dechiffrert sammensetningen av TME i HCC uavhengig av etiologi.

For å avduke forskjeller i de infiltrerende immuncellene assosiert med MASL- og virusrelaterte HCC foreslår vi følgende:

1. Pasientinnmelding, prøveinnsamling, prosessering og biobanking.
2. Analyse av ikke-tumorale lever- og tumorinfiltrerende immunceller i MASLD- og virusrelatert HCC av SCRNA-seq.
3. Intervensjon på nyoppdagede etiologiassosierte immunmekanismer identifisert i denne studien for å låse opp/øke antitumorcytotoksiske NK- og T-cellefunksjoner.

En viktig eiendel til denne studien er tilgjengeligheten av kryokonserverte kirurgiske prøver oppnådd fra tidligere innsamlede leverreseksjoner for HCC, bestående av pasienter med kroniske HBV- og HCV -infeksjoner, samt MASLD. Infiltrering av mononukleære celler er kryokonservert live i 90% føtalt kalveserum/DMSO. Dette vil gi en øyeblikkelig tilgjengelighet av biologisk materiale fra godt karakteriserte pasienter og vil tjene som et treningssett som skal valideres i en påfølgende prospektiv kohort som vil bli rekruttert under hele studien. For dette formål planlegger interne og eksterne samarbeidende kirurgiske enheter å samle cirka 20 virusrelaterte HCC-pasienter med kronisk hepatitt B- eller C-virusinfeksjon og 20 MASLD-relatert HCC ubehandlet på studietidspunktet. Komplette kliniske data vil bli samlet inn i en dedikert database. Perifere blodmononukleære celler (PBMC) vil bli oppnådd ved ficoll-pakket gradient og kryokonserver. Serum vil bli separert fra helblod og bevart ved -80 ° C. PBMC og serum avledet fra pasienter vil bli samlet for biobanking. Kirurgisk resekterte tumorprøver og matchet ikke tilstøtende ikke-tumoralt vev vil være mekanisk og enzymatisk dissosiert med det humane tumor-dissosiasjonssettet av Gentlemacs dissosiator for å skille lever- og tumorinfiltrerende mononukleære celler (henholdsvis LIM og Tim). Kortsiktig 2D-kultur vil bli etablert fra hver pasients tumorvev.

For å undersøke hvilke cellulære undergrupper og traséer er assosiert med MASLD- eller virusrelatert HCC, vil vi dra nytte av SCRNA-seq-teknologi som gir et detaljert syn på forskjeller i genuttrykk mellom celletyper eller transkriptom heterogenitet på tvers av celler av samme type. Vi vil utføre SCRNA-seq av CD45+ Lim og Tim. For dette formål vil vi isolere CD45+ celler fra LIM og TIM ved å flowcytometri cellesortering. For å forberede biblioteker fra enkeltceller vil vi bruke den mikro-brønnbaserte BD Rhapsody-plattformen. Deretter vil sekvensering av hele transkriptomet bli utført på en Illumina -sekvenseringsplattform. Vi planlegger å utføre sekvensering fra 4 til 6 pasienter for MASLD- og virusrelatert HCC. SEQGEQ ™ Desktop Bioinformatics-plattformen vil bli brukt til å analysere SCRNA-seq-data for å oppdage svært varierende gener, utføre PCA, grafbasert klynging og T-SNE. Målet vil være å sammenligne transkripsjonsprofilene til LIM og TIM avledet fra HCC med forskjellig etiologi, i tillegg til å sammenligne LIM og TIM for den samme pasienten. Differensiell genuttrykksanalyse vil bli utført med en loggskalert foldendring ≥1,5 og p-verdi <0,05. Sammenligning av gensignaturuttrykk mellom to grupper av celler vil bli utført ved bruk av uparret to-tailed Wilcoxon rang-sum-tester. Siden enkeltcelle-transkriptomikk generelt gir en enorm mengde informasjon, vil spesiell oppmerksomhet i utgangspunktet bli viet til gener som er involvert i metabolsk status, assosiert med cytotoksiske responser og frigjøring av cytotoksiske granulater, koding for aktivering og hemmende reseptorer og for immunsuppressiv/aktiverende molekyller.

Denne tilnærmingen skal føre til definisjonen av hvilke cellulære undergrupper av LIM og TIM og hvilke traséer som definerer TME for Masld- og virusrelatert HCC. Spesiell oppmerksomhet vil bli viet på cellulær undergruppe som er deputerte til immunovervåking, for eksempel NK- og T-celler og på ligandaktiverende reseptorakser involvert i tumorgjenkjenning.

Når et panel av nøkkeletiologi-assosierte immunmekanismer vil bli identifisert, vil det være viktig i) å validere funn i en større kohort og II) å målrette de mest lovende nyoppdagede traséene for å gjenopprette antitumor cytotoksiske NK- og T-cellefunksjoner.

i) Data vil bli validert på et høyere antall pasienter, dvs. måling av genuttrykk ved sanntids PCR og analyse av immuninfiltrat ved flytcytometri. ii) Vi vil utføre in vitro-eksperimenter der LIM og TIM vil bli dyrket med autologe primære HCC-celler i nærvær av molekyler og/eller mAbs som forstyrrer utvalgte veier. En kombinasjon av eksperimentelle data, bioinformatisk analyse og en omfattende revisjon av litteraturen vil være avgjørende for å identifisere det beste druggbare stedet som skal brukes til vårt formål. For eksempel vil mAbs bli brukt til å avskjære immunsuppressive molekyler og oppheve effekten av dem, eller for å stimulere aktiverende veier, eller alternativt for å blokkere hemmende reseptorer. Genekspresjonsanalyse så vel som flowcytometri, som måler cytotoksiske granulater og cytokiner frigitt fra cytotoksiske celler, vil bli brukt for å vurdere NK- og T -cellefunksjon.