Jednobuněčné profilování imunitních buněk infiltrujících játra u pacientů s HCC souvisejícím s NASH a virem: důsledky pro imunoterapii (1003rcr2022_72)

TME je infiltrována několika populacemi imunitních buněk, mezi nimiž efektorové cytotoxické T a NK buňky zprostředkovávají imuno-surveillance nádoru. Naproti tomu inhibiční subpopulace, včetně CD4+ regulačních T buněk a myeloidních buněk a makrofágů spojených s nádorem, mohou působit proti imunitním reakcím a upřednostňovat růst nádoru. Některé studie nedávno dešifrovaly složení TME v HCC bez ohledu na etiologii.

Abychom odhalili rozdíly v infiltrujících imunitních buňkách spojených s HCC souvisejícím s MASL a virem, navrhujeme následující:

1. Zápis pacienta, sběr vzorků, zpracování a biobanking.
2. Analýza netumorálních imunitních buněk infiltrujících játra a nádoru HCC souvisejících s HCC a viru pomocí ScRNA-seq.
3. Intervence na nově objevené imunitní mechanismy spojené s etiologií identifikované v této studii pro odemčení/posílení anti-nádorových cytotoxických NK a T buněk.

Jedním z hlavních aktiv této studie je dostupnost kryokonzervovaných chirurgických vzorků získaných z dříve shromážděných jaterních resekcí pro HCC, sestávající z pacientů s chronickými infekcemi HBV a HCV, stejně jako MASLD. Infiltrující mononukleární buňky jsou kryokonzervovány živě v 90% fetálním telecím séru/DMSO. To poskytne okamžitou dostupnost biologického materiálu od dobře charakterizovaných pacientů a bude sloužit jako tréninková sada, která bude validována v následné prospektivní kohortě, která bude přijata během celé studie. Za tímto účelem plánují interní a externí spolupráci chirurgických jednotek sbírat přibližně 20 pacientů s HCC souvisejícími s virem s chronickou infekcí virem hepatitidy B nebo C a 20 HCC souvisejícím s MASLD v době studie. Kompletní klinická data budou shromažďována ve vyhrazené databázi. Mononukleární buňky periferní krve (PBMC) budou získány gradientem Ficoll-Paque a kryokonzervovaným. Sérum bude odděleno od plné krve a zachováno při -80 ° C. PBMC a sérum odvozené od pacientů budou shromažďovány pro biobanking. Chirurgicky resekované vzorky nádoru a odpovídající sousední netumorální tkáň budou mechanicky a enzymaticky disociovány s soupravou pro disociaci lidského nádoru gentlemacs disociatorem pro oddělení mononukleárních buněk infiltrujících jater a nádor (Lim a Tim). Krátkodobá 2D kultura bude stanovena z nádorové tkáně každého pacienta.

Abychom prozkoumali, které buněčné podskupiny a cesty jsou spojeny s HCC souvisejícím s MASLD nebo virem, využijeme technologie ScRNA-seq, která poskytuje podrobný pohled na rozdíly v expresi genu mezi typy buněk nebo heterogenitu transkriptomu napříč buňkami stejného typu. Provedeme scra-seq CD45+ Lim a Tim. Za tímto účelem izorujeme CD45+ buňky z LIM a TIM pomocí třídění buněk průtokových cytometrie. K přípravě knihoven z jednotlivých buněk použijeme platformu BD Rhapsody založenou na mikro-well. Dále bude sekvenování celého transkriptomu provedeno na sekvenční platformě Illumina. Plánujeme provádět sekvenování od 4 do 6 pacientů pro HCC související s MASLD a virem. Platforma SEQGEQ ™ Desktop Bioinformatics bude použita k analýze dat ScRaN-Seq k detekci vysoce variabilních genů, provádění PCA, shlukování založené na grafu a T-SNE. Cílem bude porovnat transkripční profily LIM a TIM odvozené z HCC s různou etiologií, jakož i porovnání Lim a Tim stejného pacienta. Analýza diferenciální genové exprese bude provedena s log-stupnově změnou násobné změny ≥1,5 a hodnoty p <0,05. Porovnání exprese genového podpisu mezi dvěma skupinami buněk bude provedeno pomocí nepárových dvoustranných testů Wilcoxon Rank-součet. Vzhledem k tomu, že transkriptomika s jedním buňkami obecně poskytuje obrovské množství informací, bude zpočátku vyplácena zvláštní pozornost genům zapojeným do metabolického stavu spojeného s cytotoxickými odpověďmi a uvolňováním cytotoxických granulí, kódování pro aktivaci a inhibiční receptory a pro imunosupresivní/aktivační molekuly.

Tento přístup by měl vést k definici, které buněčné podmnožiny Lim a TIM a které cesty definují TME HCC související s MASLD a virem. Zvláštní pozornost bude věnována na buněčnou podmnožinu zasazenou na imunitní dohled, jako jsou NK a T buňky a na osy receptoru aktivujících ligand zapojené do rozpoznávání nádoru.

Jakmile bude identifikován panel klíčových imunitních mechanismů spojených s etiologií, bude důležité i) ověřit nálezy ve větší kohortě a ii) zacílit na nejslibnější nově objevené cesty k obnovení protinádorových cytotoxických NK a T buněčných funkcí.

i) Data budou validována na vyšším počtu pacientů, tj. Měření genové exprese PCR v reálném čase a analýzou imunitního infiltru průtokovou cytometrií. ii) Budeme provádět experimenty in vitro, ve kterých budou Lim a TIM spolu-kultivováni s autologními primárními HCC buňkami v přítomnosti molekul a/nebo mAb, které narušují vybrané cesty. Kombinace experimentálních dat, bioinformatické analýzy a rozsáhlé revize literatury bude zásadní pro identifikaci nejlepšího drogového místa, které se má použít pro náš účel. Například mAb budou použity k zachycení imunosupresivních molekul a zrušení jejich účinku nebo ke stimulaci aktivačních cest nebo alternativně blokovat inhibiční receptory. K posouzení funkce NK a T buněk bude použita analýza genové exprese a průtoková cytometrie, měření cytotoxických granulí a cytokinů uvolňovaných z cytotoxických buněk.