Profilage unique des cellules immunitaires infiltrantes du foie des patients atteints de CHC lié à la NASH et au virus: implications pour l'immunothérapie (1003rcr2022_72)

Le TME est infiltré par plusieurs populations de cellules immunitaires, parmi lesquelles les cellules cytotoxiques T et NK cytotoxiques assurent la médiation des immunosurveillances tumorales. En revanche, les sous-populations inhibiteurs, y compris les cellules T régulatrices CD4 + et les cellules myéloïdes et les macrophages associées à la tumeur, peuvent contrer les réponses immunitaires et favoriser la croissance tumorale. Certaines études ont récemment déchiffré la composition du TME dans le CHC, quelle que soit l'étiologie.

Afin de dévoiler les différences dans les cellules immunitaires infiltrantes associées au CHC lié au Masl et au virus, nous proposons ce qui suit:

1. Inscription des patients, collecte d'échantillons, traitement et biobanque.
2. Analyse des cellules immunitaires non tumorales non tumorales et infiltratantes du HCC liées à Masld et au virus par SCRNA-SEQ.
3. Intervention sur les mécanismes immunitaires associés à l'étiologie nouvellement découverts identifiés dans la présente étude pour débloquer / augmenter les fonctions NK et cellules T cytotoxiques anti-tumorales.

Un atout majeur de cette étude est la disponibilité d'échantillons chirurgicaux cryoconservés obtenus à partir de résections hépatiques précédemment collectées pour le CHC, composé de patients atteints d'infections chroniques de VHB et de VHC, ainsi que MASLD. Les cellules mononucléaires infiltrantes sont cryoconservées en direct dans le sérum de veau fœtal à 90% / DMSO. Cela fournira une disponibilité immédiate de matériel biologique de patients bien caractérisés et servira de formation qui sera validé dans une cohorte prospective ultérieure qui sera recrutée pendant toute l'étude. À cette fin, les unités chirurgicales de collaboration internes et externes prévoient de recueillir environ 20 patients atteints de CHC liés au virus atteints d'infection par le virus chronique de l'hépatite B ou C et 20 HCC liés à la MASLD non traités au moment de l'étude. Des données cliniques complètes seront collectées dans une base de données dédiée. Les cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC) seront obtenues par gradient de Ficoll-Paque et cryoconservées. Le sérum sera séparé du sang total et conservé à -80 ° C. Le PBMC et le sérum dérivés de patients seront collectés pour la biobanque. Les échantillons de tumeurs réséqués chirurgicalement et le tissu non tumoral non tumoral adjacent apparié seront dissociés mécaniquement et enzymatiquement avec le kit de dissociation tumorale humaine par le dissociateur Gentlemacs pour séparer respectivement les cellules mononucléaires infiltrant du foie et des tumeurs (LIM et TIM respectivement). La culture 2D à court terme sera établie à partir du tissu tumoral de chaque patient.

Pour étudier les sous-ensembles et voies cellulaires associés au CHC lié à Masld ou au virus, nous profiterons de la technologie SCRNA-Seq qui fournit une vision détaillée des différences d'expression des gènes entre les types de cellules ou l'hétérogénéité du transcriptome à travers les cellules du même type. Nous effectuerons SCRNA-Seq de CD45 + LIM et TIM. À cette fin, nous isolerons les cellules CD45 + de LIM et TIM par le tri des cellules de cytométrie en flux. Pour préparer des bibliothèques à partir de cellules uniques, nous utiliserons la plate-forme BD Rhapsody basée sur des micro-puits. Ensuite, le séquençage de l'ensemble du transcriptome sera effectué sur une plate-forme de séquençage Illumina. Nous prévoyons d'effectuer un séquençage de 4 à 6 patients pour le CHC lié à Masld et au virus. La plate-forme Bioinformatics de bureau SEQGEQ ™ sera utilisée pour analyser les données SCRNA-SEQ pour détecter les gènes très variables, effectuer l'ACP, le clustering basé sur des graphiques et le T-SNE. L'objectif sera de comparer les profils transcriptionnels de LIM et TIM dérivés du CHC avec une étiologie différente, ainsi que de comparer LIM et TIM du même patient. L'analyse de l'expression des gènes différentielle sera effectuée avec un changement de pli à l'échelle logarithmique ≥ 1,5 et une valeur p <0,05. La comparaison de l'expression de la signature des gènes entre deux groupes de cellules sera réalisée en utilisant des tests de somme de rang de Wilcoxon à deux queues non appariés. Étant donné que la transcriptomique unique fournit généralement une quantité massive d'informations, une attention particulière sera initialement accordée aux gènes impliqués dans le statut métabolique, associés aux réponses cytotoxiques et à la libération de granules cytotoxiques, codant pour activer et inhibiter les récepteurs et pour les molécules immunosuppressives / activatrices.

Cette approche devrait conduire à la définition de quels sous-ensembles cellulaires de LIM et TIM et quelles voies définissent le TME du CHC lié au Masld et au virus. Une attention particulière sera accordée sur le sous-ensemble cellulaire député à la surveillance immunitaire, tels que les cellules NK et T et sur les axes des récepteurs activant les ligands impliqués dans la reconnaissance tumorale.

Une fois qu'un panel de mécanismes immunitaires associés à l'étiologie sera identifié, il sera important i) de valider les résultats dans une cohorte plus grande et ii) pour cibler les voies les plus prometteuses nouvellement découvertes pour restaurer les fonctions NK cytotoxiques et cellules T anti-tumorales.

i) Les données seront validées sur un nombre plus élevé de patients, c'est-à-dire la mesure de l'expression des gènes par PCR en temps réel et l'analyse de l'infiltrat immunitaire par cytométrie en flux. ii) Nous effectuerons des expériences in vitro dans lesquelles LIM et TIM seront co-cultivés avec des cellules HCC primaires autologues en présence de molécules et / ou de mAbs qui interfèrent sur des voies sélectionnées. Une combinaison de données expérimentales, d'analyse bioinformatique et d'une révision approfondie de la littérature sera cruciale pour identifier le meilleur endroit médicamenteux à utiliser à notre objectif. Par exemple, les mAb seront utilisés pour intercepter les molécules immunosuppressives et abroger leur effet, ou pour stimuler les voies d'activation, ou, alternativement, pour bloquer les récepteurs inhibiteurs. L'analyse de l'expression des gènes ainsi que la cytométrie en flux, mesurant les granules cytotoxiques et les cytokines libérées des cellules cytotoxiques, seront utilisées pour évaluer la fonction des lymphocytes NK et T.