NASH 및 바이러스 관련 HCC 환자의 간 여과 면역 세포의 단일 세포 프로파일 링 : 면역 요법에 대한 시사점 (1003rcr2022_72)

TME는 몇몇 면역 세포 집단에 의해 침윤되며, 이는 이펙터 세포 독성 T 및 NK 세포가 종양 면역 감시를 매개한다. 대조적으로, CD4+ 조절 T 세포 및 종양 관련 골수 세포 및 대 식세포를 포함한 억제 소집단은 면역 반응에 대항하여 종양 성장을 선호 할 수있다. 일부 연구는 최근 병인학에 관계없이 HCC에서 TME의 구성을 해독했습니다.

MASL- 및 바이러스 관련 HCC와 관련된 침윤성 면역 세포의 차이를 공개하기 위해 다음을 제안합니다.

1. 환자 등록, 샘플 수집, 가공 및 바이오 뱅킹.
2. SCRNA-Seq에 의한 MASLD- 및 바이러스 관련 HCC의 비 종양 간 및 종양 침윤 면역 세포의 분석.
3. 항 종양 세포 독성 NK 및 T 세포 기능을 잠금 해제/강화하기 위해 본 연구에서 확인 된 새로 발견 된 병인 관련 면역 메커니즘에 대한 중재.

이 연구의 주요 자산 중 하나는 만성 HBV 및 HCV 감염 환자와 MASLD로 구성된 HCC에 대한 이전에 수집 된 간 절제술로부터 얻은 냉동 보존 외과 표본의 이용 가능성이다. 침투 단핵 세포는 90% 태아 송아지 혈청/DMSO에서 냉동 보존된다. 이것은 잘 특성화 된 환자로부터 생물학적 물질의 즉각적인 가용성을 제공 할 것이며, 전체 연구 중에 모집 될 후속 전망 코호트에서 검증 될 훈련 세트 역할을 할 것입니다. 이를 위해 내부 및 외부 협업 수술 단위는 만성 B- 또는 C 바이러스 감염이있는 약 20 명의 바이러스 관련 HCC 환자와 20 명의 MASLD 관련 HCC 환자를 수집 할 계획이며, 연구 당시 처리되지 않았다. 완전한 임상 데이터는 전용 데이터베이스에서 수집됩니다. 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)는 Ficoll-Paque 구배에 의해 얻어지고 동결 보존된다. 혈청은 전혈에서 분리되고 -80 ° C에서 보존됩니다. 환자로부터 유래 된 PBMC 및 혈청은 바이오 뱅킹을 위해 수집됩니다. 외과 적으로 절제된 종양 표본 및 일치하는 비 인접 비 종양 조직은 간 및 종양 침입 단핵 세포 (각각 LIM 및 TIM)를 분리하기 위해 젠틀맥 해리에 의해 인간 종양 해리 키트와 기계적으로 및 효소 적으로 해리 될 것이다. 각 환자의 종양 조직에서 단기 2D 배양이 확립 될 것입니다.

어떤 세포 서브 세트 및 경로가 MASLD 또는 바이러스 관련 HCC와 관련이 있는지 조사하기 위해 동일한 유형의 세포에 걸쳐 세포 유형 또는 전사 이질성 사이의 유전자 발현의 차이에 대한 상세한 견해를 제공하는 SCRNA-Seq 기술을 활용할 것입니다. CD45+ Lim 및 Tim의 SCRNA-seq를 수행 할 것입니다. 이를 위해, 우리는 유세포 분석 세포 분류에 의해 Lim 및 Tim으로부터 CD45+ 세포를 분리 할 것이다. 단일 셀에서 라이브러리를 준비하기 위해 마이크로 웰 기반 BD Rhapsody 플랫폼을 사용합니다. 다음으로, 전체 전 사체의 시퀀싱은 일루미나 시퀀싱 플랫폼에서 수행 될 것이다. 우리는 MASLD 및 바이러스 관련 HCC에 대해 4 ~ 6 명의 환자로 시퀀싱을 수행 할 계획입니다. SEQGEQ ™ 데스크톱 바이오 인 정보 플랫폼은 SCRNA-Seq 데이터를 분석하여 고도로 가변 유전자를 탐지하고 PCA, 그래프 기반 클러스터링 및 T-SNE를 수행하는 데 사용됩니다. 목표는 HCC에서 유래 한 LIM 및 TIM의 전사 프로파일을 다른 병인과 다른 병인과 동일한 환자의 LIM과 Tim을 비교하는 것입니다. 차등 유전자 발현 분석은 로그 스케일 폴드 변화 ≥1.5 및 p 값 <0.05로 수행 될 것이다. 두 그룹의 세포 그룹 사이의 유전자 시그니처 발현의 비교는 짝을 이루지 않은 양측 윌콕슨 랭크 스섬 테스트를 사용하여 수행 될 것이다. 단일 세포 전 사체학은 일반적으로 방대한 양의 정보를 제공하기 때문에, 세포 독성 반응 및 세포 독성 과립의 방출과 관련된 대사 상태와 관련된 유전자에 특별한주의를 기울여서, 활성화 및 억제 수용체 및 면역 억제/활성화 분자를위한 암호화.

이 접근법은 LIM 및 TIM의 세포 서브 세트와 MASLD 및 바이러스 관련 HCC의 TME를 정의하는 경로의 정의로이어야한다. NK 및 T 세포와 같은 면역 감시 및 종양 인식에 관여하는 리간드 활성화 수용체 축에 대한 대리인 세포 서브 세트에 대해 특별한주의를 기울일 것이다.

일단 주요 병인 관련 면역 메커니즘의 패널이 확인되면, 더 큰 코호트에서의 발견을 검증하는 것이 중요 할 것입니다. 그리고 ii) 항 종양 세포 독성 NK 및 T 세포 기능을 복원하기위한 가장 유망한 새로 발견 된 경로를 목표로하는 것이 중요합니다.

i) 데이터는 더 많은 수의 환자, 즉 실시간 PCR에 의해 유전자 발현을 측정하고 유세포 분석에 의한 면역 침윤을 분석 할 것이다. ii) 우리는 선택된 경로를 방해하는 분자 및/또는 mAB의 존재 하에서자가 1 차 HCC 세포와 함께 LIM 및 TIM이 공동 배양되는 시험 관내 실험을 수행 할 것이다. 실험 데이터, 생물 정보 분석 및 문헌의 광범위한 개정의 조합은 우리의 목적에 사용될 가장 좋은 약물 지점을 식별하는 데 중요합니다. 예를 들어, MAB는 면역 억제 분자를 가로 채고 그들의 효과를 폐지하거나, 활성화 경로를 자극하거나, 대안 적으로 억제 수용체를 차단하기 위해 사용될 것이다. 세포 독성 과립 및 세포 독성 세포로부터 방출 된 세포 독성 과립 및 사이토 카인을 측정하는 유전체 세포 분석법뿐만 아니라 유전자 발현 분석을 사용하여 NK 및 T 세포 기능을 평가할 것이다.