Nash- ja virusta koskevien HCC: n potilaiden maksa-tunkeutuvien immuunisolujen yksisoluinen profilointi: vaikutukset immunoterapiaan (1003rcr2022_72)

TME: tä tunkeutuvat useiden immuunisolujen populaatioiden kanssa, joista efektorisytotoksiset T- ja NK-solut välittävät kasvaimen immunotutkimusta. Sitä vastoin estävät alapopulaatiot, mukaan lukien CD4+ -säätely-T-solut ja tuumoriin liittyvät myeloidisolut ja makrofagit, voivat torjua immuunivasteita ja suosia tuumorin kasvua. Jotkut tutkimukset ovat äskettäin salanneet TME: n koostumuksen HCC: ssä etiologiasta riippumatta.

MASL- ja virus-aiheisiin HCC: hen liittyvien tunkeutuvien immuunisolujen erojen paljastamiseksi ehdotamme seuraavaa:

1. Potilaan ilmoittautuminen, näytteenkeruu, käsittely ja biopankki.
2. Masld- ja viruksiin liittyvän HCC: n ei-tuumorin ja tuumorin tunkeutuvien immuunisolujen analyysi SCRNA-Seq: llä.
3. Äskettäin löydettyjen etiologiaan liittyvien immuunimekanismien interventio, joka on tunnistettu tässä tutkimuksessa, jotta voidaan avata/lisätä kasvaimen anti-sytotoksisia NK- ja T-solujen toimintoja.

Yksi tärkeä omaisuus tähän tutkimukseen on CryoPraved -kirurgisten näytteiden saatavuus, joka on saatu aiemmin kerätyistä maksan resektioista HCC: lle, joka koostuu potilaista, joilla on krooninen HBV- ja HCV -infektiot, sekä MASLD. Sisäisistävät mononukleaariset solut säilyvät kyvyn elävänä 90%: n sikiön vasikan seerumissa/DMSO: ssa. Tämä tarjoaa biologisen materiaalin välittömän saatavuuden hyvin karakterisoiduilta potilailta ja toimii koulutusjoukona, joka validoidaan myöhemmässä mahdollisessa ryhmässä, joka rekrytoidaan koko tutkimuksen ajan. Tätä päätä varten sisäiset ja ulkoiset yhteistyössä toimivat kirurgiset yksiköt suunnittelevat keräävänsä noin 20 virusta koskevaa HCC-potilasta, joilla on krooninen hepatiitti B- tai C-virusinfektio ja 20 masldiin liittyvää HCC: tä käsittelemättä tutkimuksen aikana. Täydelliset kliiniset tiedot kerätään erillisessä tietokannassa. Perifeeriset veren mononukleaariset solut (PBMC) saadaan Ficoll-Paaque-gradientilla ja kryoporoitu. Seerumi erotetaan kokoverestä ja säilyy -80 ° C: ssa. Potilaista johdettu PBMC ja seerumi kerätään biopankkiin. Kirurgisesti resektoidut tuumorinäytteet ja vastaavat vierekkäiset ei-tuumoraaliset kudokset dissosioituvat mekaanisesti ja entsymaattisesti ihmisen kasvaimen dissosiaatiopakkauksella herraslääketieteellisillä dissosiaattoreilla maksan ja tuumorin tunkeutuvien mononukleaaristen solujen (vastaavasti) erottamiseksi (vastaavasti). Lyhytaikainen 2D-viljely muodostuu kunkin potilaan kasvainkudoksesta.

Jotta voimme tutkia, mitkä solujen alajoukot ja reitit liittyvät masld- tai viruksiin liittyvään HCC: hen, hyödynnämme SCRNA-seq-tekniikkaa, joka tarjoaa yksityiskohtaisen kuvan geeniekspression eroista solutyyppien tai transkriptoomin heterogeenisyyden välillä samantyyppisten solujen välillä. Suoritamme CD45+ LIR: n ja TIM: n SCRNA-seq. Tätä varten eristämme CD45+ -solut LIM: stä ja TIM: stä virtaussytometrian solujen lajittelulla. Kirjastojen valmistelemiseksi yksittäisistä soluista käytämme mikro-hyvin perustuvaa BD Rhapsody -alustaa. Seuraavaksi koko transkriptomin sekvensointi suoritetaan Illumina -sekvensointialustalla. Aiomme suorittaa sekvensointia 4- 6 potilasta masld- ja viruksiin liittyvän HCC: n suhteen. SEQGEQ ™ Desktop Bioinformatics -alustaa käytetään analysoimaan SCRNA-seq-tietoja erittäin muuttuvien geenien havaitsemiseksi, PCA: n, kuvaajapohjaisen klusteroinnin ja T-SNE: n suorittamiseksi. Tavoitteena on verrata LIM: n ja TIM: n transkriptionaalisia profiileja, jotka ovat peräisin HCC: stä erilaisella etiologialla, samoin kuin saman potilaan Lim- ja Tim -versioita. Geeniekspressioanalyysi suoritetaan log-skaalatulla laskosimuutoksella ≥1,5 ja P-arvo <0,05. Kahden soluryhmän välisen geenin allekirjoitusekspression vertailu suoritetaan käyttämällä parittomia kaksisuuntaisia ​​Wilcoxon Rank-Sum -kokeita. Koska yksisoluiset transkriptics tarjoaa yleensä valtavan määrän tietoa, alun perin kiinnitetään erityistä huomiota metaboliseen tilaan osallistuviin geeneihin, jotka liittyvät sytotoksisiin vasteisiin ja sytotoksisten rakeiden vapautumiseen, koodaamalla aktivoivia ja estäviä reseptoreita sekä immunosuppressiivisia/aktivoivia molekyylejä.

Tämän lähestymistavan tulisi johtaa siihen, mitkä Limin ja Timin solujen alaryhmät ja mitkä reitit määrittelevät masld- ja viruksiin liittyvän HCC: n TME: n. Erityistä huomiota kiinnitetään immuunijärjestelmään, kuten NK- ja T-soluihin ja ligandia aktivoiville reseptoriakseleille, jotka osallistuvat kasvaimen tunnistamiseen osallistuvien immuunijärjestelmän valvontaan.

Kun avain etiologiaan liittyvien immuunimekanismien paneeli tunnistetaan, on tärkeää i) validoida havainnot suuremmassa kohortissa ja II) kohdistaa lupaavimmat vasta löydetyt reitit kasvaimen vastaisen sytotoksisten NK- ja T-solutoimintojen palauttamiseksi.

i) Tiedot validoidaan suuremmalla määrällä potilaita, ts. Geeniekspression mittaaminen reaaliaikaisella PCR: llä ja immuunisuodatuksen analysoimalla virtaussytometrialla. ii) Suoritamme in vitro -kokeita, joissa Lim ja Tim viljeldään autologisten primaaristen HCC-solujen kanssa yhdessä molekyylien ja/tai mAb: ien läsnä ollessa, jotka häiritsevät valituilla reiteillä. Kokeellisen tiedon, bioinformaattisen analyysin ja kirjallisuuden laajan tarkistuksen yhdistelmä on välttämätöntä parhaan lääkekohtaisen paikan tunnistamiseksi tarkoitukseemme. Esimerkiksi MAb: ää käytetään immunosuppressiivisten molekyylien sieppaamiseen ja niiden vaikutuksen poistamiseen tai aktivoivien reittien tai vaihtoehtoisesti estämiseen estävien reseptorien estämiseen. Geeniekspressioanalyysi sekä virtaussytometria, joka mittaa sytotoksisia rakeita ja sytokiineja, jotka vapautuvat sytotoksisista soluista, käytetään NK- ja T -solujen toiminnan arvioimiseksi.