Ein-Zell-Profilerstellung von Leber-infiltrierenden Immunzellen von Patienten mit NASH- und Virus-bezogenem HCC: Auswirkungen auf die Immuntherapie (1003rcr2022_72)

Das TME wird durch mehrere Populationen von Immunzellen infiltriert, unter denen die zytotoxischen T- und NK-Zellen der Effektor-Immunveilierung die Tumor-Immunveilanz vermitteln. Im Gegensatz dazu können inhibitorische Subpopulationen, einschließlich CD4+ regulatorischer T-Zellen und tumorassoziierten myeloischen Zellen und Makrophagen, Immunantworten entgegenwirken und das Tumorwachstum bevorzugen. Einige Studien haben kürzlich die Zusammensetzung des TME in HCC unabhängig von der Ätiologie entschlüsselt.

Um Unterschiede in den infiltrierenden Immunzellen zu ermitteln, die mit dem MASL- und Virus-bedingten HCC assoziiert sind, schlagen wir Folgendes vor:

1. Patientenmeldung, Probenerfassung, Verarbeitung und Biobanking.
2. Analyse nicht-tumoraler Leber- und Tumor-infiltrierender Immunzellen von MASLD- und Virus-bezogenem HCC durch SCRNA-seq.
3. Intervention zu neu entdeckten ätiologischen assoziierten Immunmechanismen, die in der vorliegenden Studie identifiziert wurden, um die zytotoxischen NK- und T-Zellfunktionen von Antitumor-Tumor zu entsperren/zu steigern.

Ein Hauptabschnitt für diese Studie ist die Verfügbarkeit von kryokonservierten chirurgischen Proben, die aus zuvor gesammelten Leberresektionen für HCC erhalten wurden und aus Patienten mit chronischen HBV- und HCV -Infektionen sowie Masld bestehen. Infiltrierende mononukleäre Zellen sind kryokonserviert in 90% iger fetaler Kälberserum/DMSO. Dies liefert eine sofortige Verfügbarkeit von biologischem Material von gut charakterisierten Patienten und dient als Trainingssatz, die in einer nachfolgenden prospektiven Kohorte validiert werden muss, die während der gesamten Studie rekrutiert wird. Zu diesem Zweck planen interne und externe Zusammenarbeit chirurgische Einheiten, ungefähr 20 virusbedingte HCC-Patienten mit chronischer Hepatitis-B- oder C-Virus-Infektion und 20 MASLD-verwandtem HCC zum Zeitpunkt der Studie unbehandelt zu sammeln. Vollständige klinische Daten werden in einer dedizierten Datenbank erfasst. Periphere mononukleäre Blutzellen (PBMC) werden durch Ficoll-Praque-Gradienten erhalten und kryokonserviert. Das Serum wird von Vollblut getrennt und bei -80 ° C erhalten. PBMC und Serum, die von Patienten abgeleitet werden, werden zum Biobanking gesammelt. Chirurgisch resezierte Tumorproben und übereinstimmende nicht benachbarte nicht-tumorale Gewebe werden mechanisch und enzymatisch mit dem menschlichen Tumordissoziations-Kit durch Gentlemacs-Dissoziator zum Trennen von mononukleären Zellen von Leber und Tumorinfiltrierung (LIM bzw. TIM) dissoziiert. Die kurzfristige 2D-Kultur wird aus dem Tumorgewebe jedes Patienten festgestellt.

Um zu untersuchen, welche zellulären Untergruppen und Wege mit MASLD- oder Virus-bezogenem HCC assoziiert sind, werden wir die SCRNA-Seq-Technologie nutzen, die eine detaillierte Sicht auf die Unterschiede in der Genexpression zwischen Zelltypen oder Transkriptom-Heterogenität über Zellen desselben Typs bietet. Wir werden SCRNA-seq von CD45+ Lim und Tim durchführen. Zu diesem Zweck werden wir CD45+ -Zellen aus Lim und Tim durch Sortieren von Zellen der Durchflusszytometrie isolieren. Um Bibliotheken aus einzelnen Zellen vorzubereiten, verwenden wir die BD-Rhapsody-Plattform auf Mikro-Well-Basis. Als nächstes wird die Sequenzierung des gesamten Transkriptoms auf einer Illumina -Sequenzierungsplattform durchgeführt. Wir planen, eine Sequenzierung von 4 bis 6 Patienten für MASLD- und Virus-bezogene HCC durchzuführen. Die SEQGEQ ™ Desktop-Bioinformatik-Plattform wird verwendet, um SCRNA-Seq-Daten zu analysieren, um hoch variable Gene zu erkennen, PCA, graphbasierte Clustering und T-Sne durchzuführen. Das Ziel wird es sein, die von HCC abgeleiteten Transkriptionsprofile von Lim und Tim mit unterschiedlicher Ätiologie zu vergleichen und Lim und Tim desselben Patienten zu vergleichen. Die differentielle Genexpressionsanalyse wird mit einer logarithmischen Faltveränderung ≥ 1,5 und P-Wert <0,05 durchgeführt. Der Vergleich der Gen-Signaturexpression zwischen zwei Gruppen von Zellen wird unter Verwendung von ungepaarten zweiseitigen Wilcoxon-Rang-Summen-Tests durchgeführt. Da Einzelzelltranskriptomik im Allgemeinen eine große Menge an Informationen liefert, wird zunächst besondere Aufmerksamkeit auf Gene geschenkt, die am Stoffwechselstatus beteiligt sind und mit zytotoxischen Reaktionen und Freisetzung von zytotoxischen Granulaten, kodierenden und inhibitorischen Rezeptoren sowie für immunsuppressive/aktivatorische Moleküle verbunden sind.

Dieser Ansatz sollte dazu führen, dass die Definition von Lim und TIM zelluläre Untergruppen von Lim und TIM und welche Wege das TME des HCC-bezogenen Masld- und Virus definieren. Besondere Aufmerksamkeit wird auf die zelluläre Untergruppe zur Immunüberwachung wie NK- und T-Zellen sowie auf ligandenaktivierende Rezeptorachsen gelegt, die an der Tumorerkennung beteiligt sind.

Sobald eine Gruppe von wichtigen ätiologischen Immunmechanismen identifiziert wird, wird es wichtig sein, die Ergebnisse in einer größeren Kohorte zu validieren, und ii), um die vielversprechendsten neu entdeckten Wege zur Wiederherstellung der zytotoxischen Antitumor-zytotoxischen NK- und T-Zellfunktionen abzuzielen.

i) Die Daten werden an einer höheren Anzahl von Patienten validiert, d. H. Die Messung der Genexpression durch Echtzeit-PCR und die Analyse des Immuninfiltrats durch Durchflusszytometrie. ii) Wir werden In-vitro-Experimente durchführen, in denen Lim und TIM in Gegenwart von Molekülen und/oder mAbs, die ausgewählte Wege stören, mit autologen primären HCC-Zellen gemeinsam kultiviert werden. Eine Kombination aus experimentellen Daten, bioinformatischer Analyse und einer umfassenden Überarbeitung der Literatur ist entscheidend, um den besten drogengierbaren Ort für unseren Zweck zu identifizieren. Beispielsweise werden mAbs verwendet, um immunsuppressive Moleküle abzufangen und ihre Wirkung aufzuheben oder die Aktivierungswege zu stimulieren oder alternativ inhibitorische Rezeptoren zu blockieren. Die Genexpressionsanalyse sowie die Durchflusszytometrie, die die zytotoxischen Granulate und Zytokine, die aus zytotoxischen Zellen freigesetzt werden, messen, werden zur Bewertung der NK- und T -Zellfunktion verwendet.