Perfil de célula de células de células imunes infiltrantes de fígado de pacientes com HCC relacionado a Nash e vírus: implicações para imunoterapia (1003rcr2022_72)

O TME é infiltrado por várias populações de células imunes, entre as quais as células t citotóxicas e NK efetoras mediam a imuno-surveilância tumoral. Por outro lado, as subpopulações inibitórias, incluindo células T reguladoras de CD4+ e células mielóides e macrófagos associadas ao tumor, podem neutralizar as respostas imunes e favorecer o crescimento do tumor. Alguns estudos decifraram recentemente a composição do TME no CHC, independentemente da etiologia.

A fim de revelar diferenças nas células imunes infiltrantes associadas ao HCC relacionado ao MASL e ao vírus, propomos o seguinte:

1. Inscrição do paciente, coleta de amostras, processamento e biobanização.
2. Análise de células imunológicas infiltrantes de fígado e tumor não tumorais do HCC relacionado ao masld e vírus por scRNA-seq.
3. Intervenção em mecanismos imunológicos associados à etiologia recém-descobertos identificados no presente estudo para desbloquear/aumentar as funções citotóxicas de NK e células T antitumorais.

Um dos principais ativos deste estudo é a disponibilidade de amostras cirúrgicas criopreservadas obtidas de ressecções hepáticas anteriormente coletadas para o CHC, consistindo em pacientes com infecções crônicas de HBV e HCV, bem como MASLD. As células mononucleares infiltrantes são criopreservadas ao vivo em soro de bezerro fetal a 90%/DMSO. Isso fornecerá uma disponibilidade imediata de material biológico de pacientes bem caracterizados e servirá como um conjunto de treinamento que será validado em uma coorte prospectiva subsequente que será recrutada durante todo o estudo. Para esse fim, as unidades cirúrgicas colaboradoras internas e externas planejam coletar aproximadamente 20 pacientes com CHC relacionados ao vírus com infecção crônica por vírus da hepatite B ou C e 20 HCC relacionado ao MASLD não tratados no momento do estudo. Os dados clínicos completos serão coletados em um banco de dados dedicado. As células mononucleares do sangue periférico (PBMC) serão obtidas por gradiente de ficoll-paque e criopreservadas. O soro será separado do sangue total e preservado a -80 ° C. PBMC e soro derivados de pacientes serão coletados para a biobanização. As amostras de tumores ressecadas cirurgicamente e o tecido não adjacente não adjacente não adjacente serão dissociadas mecanicamente e enzimaticamente com o kit de dissociação de tumor humano por cavalheiros dissociadores para separar células mononucleares infiltradas no fígado e tumor (LIM e Tim, respectivamente). A cultura 2D de curto prazo será estabelecida a partir do tecido tumoral de cada paciente.

Para investigar quais subconjuntos e vias celulares estão associados ao HCC relacionado ao MASLD ou do vírus, aproveitaremos a tecnologia SCRNA-seq que fornece uma visão detalhada das diferenças na expressão gênica entre os tipos de células ou a heterogeneidade do transcriptoma entre as células do mesmo tipo. Realizaremos scrna-seq de CD45+ lim e Tim. Para esse fim, isolaremos as células CD45+ de LIM e TIM por classificação de células de citometria de fluxo. Para preparar bibliotecas a partir de células únicas, usaremos a plataforma BD Rhapsody baseada em micro-poço. Em seguida, o sequenciamento de todo o transcriptoma será realizado em uma plataforma de sequenciamento Illumina. Planejamos realizar sequenciação de 4 a 6 pacientes para CHC relacionado ao MASLD e do vírus. A plataforma Bioinformática da Desktop seqgeq ™ será usada para analisar dados SCRNA-Seq para detectar genes altamente variáveis, executar PCA, cluster baseado em gráficos e T-SNE. O objetivo será comparar os perfis transcricionais de LIM e TIM derivados do CHC com etiologia diferente, além de comparar LIM e TIM do mesmo paciente. A análise de expressão gênica diferencial será realizada com uma mudança de dobra em escala log ≥1,5 e p valor <0,05. A comparação da expressão de assinatura de genes entre dois grupos de células será realizada usando testes de soma de rank de Wilcoxon não pareados. Como a transcriptômica de célula única geralmente fornece uma quantidade enorme de informações, atenção especial será inicialmente dada aos genes envolvidos no status metabólico, associado a respostas citotóxicas e liberação de grânulos citotóxicos, codificando para ativadores e receptores inibitórios e para moléculas imunossupressas/ativadoras.

Essa abordagem deve levar à definição de quais subconjuntos celulares de LIM e TIM e quais vias definem o TME do HCC relacionado ao MASLD e do vírus. Atenção especial será dada sobre o subconjunto celular, deputado à vigilância imunológica, como as células NK e T e os eixos receptores que ativam o ligante envolvidos no reconhecimento de tumores.

Uma vez que um painel de mecanismos imunológicos associados à etiologia principal será identificado, será importante i) validar as descobertas em uma coorte maior e ii) atingir as vias mais promissoras recentemente descobertas para restaurar as funções de NK e células T antitumorais.

i) Os dados serão validados em um número maior de pacientes, ou seja, medindo a expressão gênica por PCR em tempo real e analisando o infiltrado imunológico por citometria de fluxo. ii) Realizaremos experimentos in vitro nos quais Lim e Tim serão co-cultivados com células primárias autólogas HCC na presença de moléculas e/ou mAbs que interferem nas vias selecionadas. Uma combinação de dados experimentais, análise bioinformática e uma extensa revisão da literatura serão cruciais para identificar o melhor ponto de droga a ser usado para nossa finalidade. Por exemplo, os mAbs serão usados ​​para interceptar moléculas imunossupressoras e anular seu efeito, ou estimular as vias ativadoras, ou, alternativamente, para bloquear os receptores inibitórios. A análise da expressão gênica, bem como a citometria de fluxo, medindo os grânulos citotóxicos e as citocinas liberadas das células citotóxicas, será empregada para avaliar a função de NK e células T.