Профилирование одноклеточных иммунных клеток пациентов с HCC, связанных с NASH и вирусом: последствия для иммунотерапии. (1003rcr2022_72)

TME инфильтрируется несколькими популяциями иммунных клеток, среди которых эффекторные цитотоксические T и NK-клетки опосредуют иммунопередачу опухоли. Напротив, ингибирующие субпопуляции, включая CD4+ регуляторные Т-клетки, а также ассоциированные с опухолью миелоидные клетки и макрофаги, могут противодействовать иммунным реакциям и способствовать росту опухоли. Некоторые исследования недавно расшифровали состав TME в HCC независимо от этиологии.

Чтобы представить различия в инфильтрирующих иммунных клетках, связанных с HCC, связанным с MASL и вирусом, мы предлагаем следующее:

1. Зачисление пациентов, сбор образцов, обработка и биобанкинг.
2. Анализ не точечных иммунных иммунных клеток печеночных и опухоли, связанных с MASLD и вирусом, с помощью SCRNA-seq.
3. Вмешательство на недавно обнаруженные иммунные механизмы, связанные с этиологией, идентифицированные в настоящем исследовании, чтобы разблокировать/усилить противоопухолевые цитотоксические NK и Т-клеточные функции.

Одним из основных активов этого исследования является доступность криоконсервированных хирургических образцов, полученных из ранее собранных резекций печени для ГЦК, состоящих из пациентов с хроническими инфекциями HBV и HCV, а также MASLD. Инфильтрирующие мононуклеарные клетки криоконсервируются в живых в 90% плода -теленке сыворотка/ДМСО. Это обеспечит немедленную доступность биологического материала от хорошо охарактеризованных пациентов и будет служить учебным набором, который должен быть подтвержден в последующей проспективной группе, которая будет набирается во время всего исследования. С этой целью внутренние и внешние совместные хирургические единицы планируют собрать приблизительно 20 пациентов, связанных с вирусом, с хроническим гепатитом B- или C-вирусной инфекцией и 20 связанных с MASLD HCC, не обработанными во время исследования. Полные клинические данные будут собираться в специальной базе данных. Мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC) будут получены с помощью градиента Ficoll-Paque и криоконсервированного. Сыворотка будет отделена от цельной крови и сохранена при -80 ° C. PBMC и сыворотка, полученные от пациентов, будут собираться для биобанки. Хирургически резецированные образцы опухоли и совпадающие не соседнюю не точечную ткань будут механически и ферментативно диссоциированы с набором для диссоциации опухолей человека джентльмаками диссоциатора для отделения мононуклеарных клеток, инфильтрирующих печени и опухоли (LIM и TIM, соответственно). Краткосрочная 2D-культура будет установлена ​​из опухолевой ткани каждого пациента.

Чтобы исследовать, какие клеточные подмножества и пути связаны с HCC, связанным с MASLD или вирусом, мы воспользуемся преимуществами технологии SCRNA-seq, которая обеспечивает подробное представление о различиях в экспрессии генов между типами клеток или гетерогенности транскриптома между клетками того же типа. Мы будем выполнять SCRNA-seq из CD45+ LIM и TIM. С этой целью мы будем изолировать клетки CD45+ от LIM и TIM с помощью сортировки клеток проточной цитометрии. Чтобы подготовить библиотеки из отдельных ячейков, мы будем использовать платформу BD Rhapsody на основе микро-лудов. Далее, секвенирование всего транскриптома будет выполнена на платформе секвенирования Illumina. Мы планируем выполнить секвенирование от 4 до 6 пациентов для HCC, связанных с MASLD и вирусом. Платформа настольной биоинформатики SEQGEQ ™ будет использоваться для анализа данных SCRNA-Seq для обнаружения генов с высокой вариабельной, выполнения PCA, кластеризации на основе графика и T-SNE. Цель будет состоять в том, чтобы сравнить профили транскрипции Лим и Тим, полученные из ГЦК с различной этиологией, а также сравнение Лим и Тим с одного и того же пациента. Дифференциальный анализ экспрессии генов будет проводиться с помощью логарифмированного изменения сгиба ≥1,5 и значения P <0,05. Сравнение экспрессии генной сигнатуры между двумя группами клеток будет проведено с использованием непарных двухсторонних тестов на ранг-сумму Уилкоксона. Поскольку одноклеточная транскриптомика обычно предоставляет огромное количество информации, первоначально особое внимание будет уделено генам, участвующим в метаболическом статусе, связанных с цитотоксическими реакциями и высвобождением цитотоксических гранул, кодирующих для активации и ингибирующих рецепторов и для иммуносепрессивных/активирующих молекул.

Этот подход должен привести к определению того, какие клеточные подмножества Лим и Тима и какие пути определяют TME HCC, связанных с MASLD и вирусом. Особое внимание будет уделено клеточному подмножеству, депутатируемому иммунному наблюдению, таким как NK и Т-клетки, а также на оси рецептора, активирующие лиганд, участвующие в распознавании опухоли.

После того, как будет идентифицирована группа иммунных механизмов, связанных с этиологией, будет важно проверить результаты в более крупной когорте и ii) для нацеливания наиболее перспективных вновь обнаруженных путей для восстановления противоопухолевых цитотоксических NK и Т-клеточных функций.

i) Данные будут подтверждены на более высоком количестве пациентов, то есть измерение экспрессии генов с помощью ПЦР в реальном времени и анализ иммунного инфильтрата с помощью проточной цитометрии. ii) Мы проведем эксперименты in vitro, в которых LIM и TIM будут совместно культивированы с аутологичными первичными клетками HCC в присутствии молекул и/или MAb, которые мешают выбранным путям. Комбинация экспериментальных данных, биоинформатического анализа и обширного пересмотра литературы будет иметь решающее значение для определения наилучшего лекарственного места, которое будет использоваться для нашей цели. Например, MAB будут использоваться для перехвата иммуносупрессивных молекул и отмены их эффекта, или для стимуляции активирующих путей, или, альтернативно, блокировать ингибирующие рецепторы. Анализ экспрессии генов, а также проточная цитометрия, измерение цитотоксических гранул и цитокинов, высвобождаемых из цитотоксических клеток, будет использоваться для оценки функции NK и T -клеток.