Profilatura a singola cellula di cellule immunitarie infiltranti epatiche di pazienti con HCC correlato a NASH e virus: implicazioni per l'immunoterapia (1003rcr2022_72)

La TME è infiltrata da diverse popolazioni di cellule immunitarie, tra cui le cellule T e NK citotossiche effettrici mediano l'immuno-sospensione tumorale. Al contrario, le sottopopolazioni inibitorie, comprese le cellule T regolatorie CD4+ e le cellule mieloidi e i macrofagi associati al tumore, possono contrastare le risposte immunitarie e favorire la crescita tumorale. Alcuni studi hanno recentemente decifrato la composizione del TME in HCC indipendentemente dall'eziologia.

Al fine di svelare le differenze nelle cellule immunitarie infiltranti associate all'HCC correlato al MASL e al virus, proponiamo quanto segue:

1. Iscrizione dei pazienti, raccolta del campione, elaborazione e biobanking.
2. Analisi di cellule immunitarie non tumorali e fegre infiltranti di HCC correlato a Masld e virus da parte di SCRNA-Seq.
3. Intervento su meccanismi immunitari associati all'eziologia appena scoperti identificati nel presente studio per sbloccare/aumentare le funzioni di cellule NK e T antitumorali.

Una grande risorsa di questo studio è la disponibilità di campioni chirurgici crioconservati ottenuti da resezioni epatiche precedentemente raccolte per HCC, costituiti da pazienti con infezioni croniche di HBV e HCV, nonché MASLD. Le cellule mononucleate infiltranti sono crioconserve dal vivo nel siero/DMSO del vitello fetale al 90%. Ciò fornirà una disponibilità immediata di materiale biologico da pazienti ben caratterizzati e fungerà da set di addestramento che deve essere validato in una successiva coorte prospettica che verrà reclutata durante l'intero studio. A tal fine, le unità chirurgiche di collaborazione interne ed esterne prevedono di raccogliere circa 20 pazienti con HCC correlati al virus con infezione da virus epatite cronica B- o C e 20 HCC correlato a Masld non trattati al momento dello studio. I dati clinici completi saranno raccolti in un database dedicato. Le cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) saranno ottenute dal gradiente ficoll-paque e crioconservate. Il siero sarà separato dal sangue intero e preservato a -80 ° C. PBMC e siero derivati ​​da pazienti saranno raccolti per il biobanking. I campioni tumorali resecati chirurgicamente e il tessuto non tumorale non adiacente abbinato saranno dissociati meccanicamente ed enzimaticamente con il kit di dissociazione tumorale umano da parte del dissociatore Gentlemacs per separare le cellule mononucleari che si infiltrano con infiltrazioni (Lim e Tim rispettivamente). La coltura 2D a breve termine sarà stabilita dal tessuto tumorale di ciascun paziente.

Per studiare quali sottogruppi cellulari e percorsi sono associati all'HCC correlato a MASD o virus, trarremo vantaggio dalla tecnologia SCRNA-Seq che fornisce una visione dettagliata sulle differenze nell'espressione genica tra i tipi di cellule o l'eterogeneità del trascrittoma tra cellule dello stesso tipo. Eseguiremo Scrna-Seq di CD45+ Lim e Tim. A tal fine, isoleremo le cellule CD45+ da Lim e Tim mediante smistamento delle cellule di citometria a flusso. Per preparare le librerie da singole celle utilizzeremo la piattaforma BD Rhapsody basata su micro-pozzetti. Successivamente, il sequenziamento dell'intero trascrittoma verrà eseguito su una piattaforma di sequenziamento Illumina. Stiamo pianificando di eseguire il sequenziamento da 4 a 6 pazienti per l'HCC correlato a Masld e virus. La piattaforma di bioinformatica Desktop SEQGEQ ™ verrà utilizzata per analizzare i dati SCRNA-Seq per rilevare geni altamente variabili, eseguire PCA, clustering basato su grafici e T-SNE. L'obiettivo sarà quello di confrontare i profili trascrizionali di LIM e TIM derivati ​​dall'HCC con eziologia diversa, nonché a confrontare LIM e TIM dello stesso paziente. L'analisi dell'espressione genica differenziale verrà condotta con una variazione di piega in scala log ≥1,5 e valore p <0,05. Il confronto tra l'espressione della firma genica tra due gruppi di cellule verrà eseguito utilizzando test di somma Wilcoxon a due code non accoppiati. Poiché la trascrittomica a cellula singola fornisce generalmente una quantità enorme di informazioni, inizialmente verrà prestata un'attenzione speciale ai geni coinvolti nello stato metabolico, associati a risposte citotossiche e al rilascio di granuli citotossici, codificando per l'attivazione e i recettori inibitori e per le molecole immunosoppressive/attivative.

Questo approccio dovrebbe portare alla definizione di quali sottoinsiemi cellulari di Lim e TIM e quali percorsi definiscono il TME dell'HCC correlato al MASLD e del virus. Particolare attenzione verrà prestata al sottoinsieme cellulare deputato alla sorveglianza immunitaria, come le cellule NK e T e sugli assi dei recettori attivanti a ligando coinvolti nel riconoscimento del tumore.

Una volta identificato un gruppo di meccanismi immunitari associati all'eziologia chiave, sarà importante i) convalidare i risultati in una coorte più ampia e II) per colpire i percorsi più promettenti di recente scoperta per ripristinare le funzioni di NK e T di NK e T.

i) I dati saranno validati su un numero più elevato di pazienti, ovvero misurando l'espressione genica mediante PCR in tempo reale e analizzando l'infiltrato immunitario mediante citometria a flusso. ii) eseguiremo esperimenti in vitro in cui Lim e Tim saranno co-coltivati ​​con cellule HCC primarie autologhe in presenza di molecole e/o mAb che interferiscono su percorsi selezionati. Una combinazione di dati sperimentali, analisi bioinformatica e una vasta revisione della letteratura sarà cruciale per identificare il miglior punto drogabile da utilizzare per il nostro scopo. Ad esempio, i mAb verranno utilizzati per intercettare le molecole immunosoppressive e abrogare il loro effetto o per stimolare le vie di attivazione o, in alternativa, bloccare i recettori inibitori. L'analisi dell'espressione genica e la citometria a flusso, che misurano i granuli citotossici e le citochine rilasciate dalle cellule citotossiche, saranno impiegate per valutare la funzione NK e delle cellule T.