Enkeltcelleprofilering af leverinfiltrerende immunceller fra patienter med NASH- og virusrelateret HCC: Implikationer for immunterapi (1003rcr2022_72)

TME er infiltreret af adskillige populationer af immunceller, blandt hvilke effektor cytotoksiske T- og NK-celler medierer tumorimmuno-overflod. I modsætning hertil kan inhiberende underpopulationer, herunder CD4+ regulatoriske T-celler og tumorassocierede myeloide celler og makrofager, modvirke immunresponser og favorisere tumorvækst. Nogle undersøgelser har for nylig dechifferet sammensætningen af ​​TME i HCC uanset etiologi.

For at afsløre forskelle i de infiltrerende immunceller, der er forbundet med MASL- og virusrelateret HCC, foreslår vi følgende:

1. Patienttilmelding, prøveopsamling, behandling og biobanking.
2. Analyse af ikke-tumoral lever- og tumorinfiltrerende immunceller af MASLD- og virusrelateret HCC af SCRNA-seq.
3. Intervention på nyligt opdagede etiologi-associerede immunmekanismer identificeret i den nuværende undersøgelse for at låse/øge antitumorcytotoksiske NK- og T-cellefunktioner.

Et vigtigt aktiv for denne undersøgelse er tilgængeligheden af ​​kryokonserverede kirurgiske prøver, der er opnået fra tidligere indsamlede leverresektioner til HCC, bestående af patienter med kroniske HBV- og HCV -infektioner samt MASLD. Infiltrerende mononukleære celler er kryokonserveret live i 90% føtal kalveserum/DMSO. Dette vil give en øjeblikkelig tilgængelighed af biologisk materiale fra godt karakteriserede patienter og vil fungere som et træningssæt, der skal valideres i en efterfølgende potentiel kohort, der rekrutteres under hele undersøgelsen. Til dette formål planlægger interne og eksterne samarbejde kirurgiske enheder at indsamle ca. 20 virusrelaterede HCC-patienter med kronisk hepatitis B- eller C-virusinfektion og 20 MASLD-relateret HCC ubehandlet på tidspunktet for undersøgelsen. Komplette kliniske data indsamles i en dedikeret database. Perifere mononukleære blodceller (PBMC) opnås ved ficoll-paque gradient og kryopreserveret. Serum vil blive adskilt fra helblod og konserveret ved -80 ° C. PBMC og serum afledt af patienter vil blive indsamlet til biobanking. Kirurgisk resekterede tumorprøver og matchede ikke-tilstødende ikke-tumoralt væv vil være mekanisk og enzymatisk dissocieret med de humane tumordissocieringssæt med Gentlemacs dissociator til separate lever- og tumorinfiltrerende mononukleære celler (henholdsvis LIM og TIM). Kortvarig 2D-kultur etableres fra hver patients tumorvæv.

For at undersøge, hvilke cellulære undergrupper og veje der er forbundet med MASLD- eller virusrelateret HCC, vil vi drage fordel af SCRNA-seq-teknologi, der giver et detaljeret billede af forskelle i genekspression mellem celletyper eller transkriptom heterogenitet på tværs af celler af samme type. Vi udfører SCRNA-seq af CD45+ LIM og TIM. Til dette formål isolerer vi CD45+ -celler fra LIM og TIM ved flowcytometri -cellesortering. For at forberede biblioteker fra enkeltceller bruger vi den mikrobrøndbaserede BD Rhapsody-platform. Dernæst udføres sekventering af hele transkriptomet på en Illumina -sekventeringsplatform. Vi planlægger at udføre sekventering fra 4 til 6 patienter til MASLD- og virusrelateret HCC. SEQGEQ ™ desktop bioinformatikplatform vil blive brugt til at analysere SCRNA-seq-data til at detektere meget variable gener, udføre PCA, grafbaseret klynger og T-SNE. Målet vil være at sammenligne de transkriptionelle profiler af LIM og Tim afledt fra HCC med forskellig etiologi samt sammenligne LIM og TIM af den samme patient. Differentialgenekspressionsanalyse vil blive udført med en log-skaleret foldændring ≥1,5 og P-værdi <0,05. Sammenligning af gensignaturekspression mellem to grupper af celler vil blive udført ved hjælp af uparret to-halede Wilcoxon rang-sum-tests. Da enkeltcelletranskriptomik generelt giver en enorm mængde information, vil der oprindeligt blive rettet særlig opmærksomhed på gener, der er involveret i den metaboliske status, forbundet med cytotoksiske responser og frigivelse af cytotoksiske granuler, der koder for aktivering og inhiberende receptorer og for immunsuppressive/aktivatoriske molekyler.

Denne fremgangsmåde skal føre til definitionen af, hvilke cellulære undergrupper af LIM og TIM, og hvilke veje, der definerer TME for Masld- og virusrelateret HCC. Særlig opmærksomhed vil blive lagt på cellulær undergruppe deputeret til immunovervågning, såsom NK- og T-celler og på ligand-aktiverende receptorøkser involveret i tumorgenkendelse.

Når et panel af nøgleetiologi-associerede immunmekanismer vil blive identificeret, vil det være vigtigt i) at validere fund i en større kohort og II) for at målrette de mest lovende nyligt opdagede veje til at gendanne antitumorcytotoksiske NK- og T-cellefunktioner.

i) Data valideres på et højere antal patienter, dvs. måling af genekspression ved realtid PCR og analyse af immuninfiltrat ved flowcytometri. ii) Vi vil udføre in vitro-eksperimenter, hvor LIM og TIM vil blive co-dyrket med autologe primære HCC-celler i nærvær af molekyler og/eller mAbs, der interfererer på udvalgte veje. En kombination af eksperimentelle data, bioinformatisk analyse og en omfattende revision af litteraturen vil være afgørende for at identificere det bedste druggable sted, der skal bruges til vores formål. For eksempel vil mAbs blive brugt til at aflytte immunsuppressive molekyler og ophøre deres virkning eller til at stimulere aktiverende veje eller alternativt til at blokere inhiberende receptorer. Genekspressionsanalyse såvel som flowcytometri, der måler de cytotoksiske granuler og cytokiner frigivet fra cytotoksiske celler, vil blive anvendt til at vurdere NK- og T -cellefunktion.