Profilering van eencellen van lever-infiltrerende immuuncellen van patiënten met NASH- en virus-gerelateerde HCC: implicaties voor immunotherapie (1003rcr2022_72)

De TME wordt geïnfiltreerd door verschillende populaties van immuuncellen, waaronder effector cytotoxische T- en NK-cellen bemiddelen tumor-immuno-surveillance. Daarentegen kunnen remmende subpopulaties, waaronder CD4+ regulerende T-cellen en tumor-geassocieerde myeloïde cellen en macrofagen, immuunresponsen tegengaan en tumorgroei bevorderen. Sommige studies hebben onlangs de samenstelling van de TME in HCC ontcijferd, ongeacht de etiologie.

Om verschillen te onthullen in de infiltrerende immuuncellen geassocieerd met MASL- en virus-gerelateerde HCC stellen we het volgende voor:

1. Patiëntinschrijving, monsterverzameling, verwerking en biobanking.
2. Analyse van niet-tumorale lever- en tumorinfiltrerende immuuncellen van MASLD- en virus-gerelateerde HCC door scRNA-seq.
3. Interventie op nieuw ontdekte etiologie-geassocieerde immuunmechanismen geïdentificeerd in de huidige studie om anti-tumor cytotoxische NK- en T-celfuncties te ontgrendelen/boost.

Een belangrijke troef voor deze studie is de beschikbaarheid van cryopreserveerde chirurgische monsters verkregen uit eerder verzamelde leverresecties voor HCC, bestaande uit patiënten met chronische HBV- en HCV -infecties, evenals MASLD. Infiltrerende mononucleaire cellen worden live cryopreserveerd in 90% foetaal kalfsserum/DMSO. Dit biedt een onmiddellijke beschikbaarheid van biologisch materiaal van goed gekarakteriseerde patiënten en zal dienen als een trainingsset die wordt gevalideerd in een daaropvolgend prospectief cohort dat tijdens de hele studie zal worden aangeworven. Daartoe zijn interne en externe samenwerkende chirurgische eenheden van plan om ongeveer 20 virusgerelateerde HCC-patiënten te verzamelen met chronische hepatitis B- of C-virusinfectie en 20 MASLD-gerelateerde HCC onbehandeld op het moment van de studie. Volledige klinische gegevens worden verzameld in een speciale database. Mononucleaire cellen van perifere bloed (PBMC) worden verkregen door Ficoll-Paque Gradiënt en cryopreserveerd. Serum wordt gescheiden van volbloed en bewaard bij -80 ° C. PBMC en serum afgeleid van patiënten zullen worden verzameld voor biobanking. Chirurgisch geresecteerd tumorspecimens en gematcht niet-aangrenzend niet-tumoraal weefsel zal mechanisch en enzymatisch worden gedissocieerd met de menselijke tumor dissociatiekit door heren dissociateur om lever- en tumor-infiltrerende mononucleaire cellen te scheiden (respectievelijk lim en TIM). De 2D-cultuur op korte termijn zal worden vastgesteld uit het tumorweefsel van elke patiënt.

Om te onderzoeken welke cellulaire subsets en routes worden geassocieerd met MASLD- of virus-gerelateerde HCC, zullen we profiteren van scrNA-seq-technologie die een gedetailleerd beeld biedt op verschillen in genexpressie tussen celtypen of transcriptoom heterogeniteit over cellen van hetzelfde type. We zullen scrNA-seq van CD45+ Lim en Tim uitvoeren. Daartoe zullen we CD45+ -cellen van Lim en Tim isoleren door flowcytometriecelsorten. Om bibliotheken van afzonderlijke cellen te bereiden, zullen we het op micro-well gebaseerde BD Rhapsody-platform gebruiken. Vervolgens wordt de sequencing van het hele transcriptoom uitgevoerd op een Illumina -sequencingplatform. We zijn van plan om sequencing uit te voeren van 4 tot 6 patiënten voor MASLD- en virus-gerelateerde HCC. Het SEQGEQ ™ Desktop Bioinformatics-platform zal worden gebruikt om scRNA-seq-gegevens te analyseren om zeer variabele genen te detecteren, PCA, op grafiek gebaseerde clustering en T-SNE uit te voeren. Het doel zal zijn om de transcriptionele profielen van LIM en Tim afkomstig van HCC te vergelijken met verschillende etiologie, evenals het vergelijken van Lim en Tim van dezelfde patiënt. Differentiële genexpressie-analyse wordt uitgevoerd met een log-geschaalde vouwverandering ≥1,5 en P-waarde <0,05. Vergelijking van gensignatuuruitdrukking tussen twee groepen cellen zal worden uitgevoerd met behulp van niet-gepaarde tweezijdige Wilcoxon Rank-Sum-tests. Aangezien transcriptomics met één cellen over het algemeen een enorme hoeveelheid informatie biedt, zal in eerste instantie speciale aandacht worden besteed aan genen die betrokken zijn bij de metabole status, geassocieerd met cytotoxische responsen en afgifte van cytotoxische korrels, codering voor activerende en remmende receptoren en voor immunosuppressieve/activerende moleculen.

Deze benadering moet leiden tot de definitie van welke cellulaire subsets van Lim en Tim en welke routes de TME van MASLD- en virus-gerelateerde HCC definiëren. Speciale aandacht zal worden besteed aan cellulaire subset die wordt gedeput voor immuunbewaking, zoals NK- en T-cellen en op ligand-activerende receptorassen die betrokken zijn bij tumorherkenning.

Zodra een panel van belangrijke etiologie-geassocieerde immuunmechanismen zal worden geïdentificeerd, zal het belangrijk zijn i) om bevindingen in een groter cohort te valideren en ii) om zich te richten op de meest veelbelovende nieuw ontdekte routes om anti-tumor cytotoxische NK- en T-celfuncties te herstellen.

i) Gegevens worden gevalideerd bij een hoger aantal patiënten, d.w.z. het meten van genexpressie door realtime PCR en het analyseren van immuuninfiltraat door flowcytometrie. ii) We zullen in vitro-experimenten uitvoeren waarin LIM en Tim worden gecultiveerd met autologe primaire HCC-cellen in aanwezigheid van moleculen en/of mAbs die interfereren op geselecteerde routes. Een combinatie van experimentele gegevens, bioinformatische analyse en een uitgebreide herziening van de literatuur zal cruciaal zijn om de beste medicijnbare plek te identificeren die voor ons doel moet worden gebruikt. MAB's zullen bijvoorbeeld worden gebruikt om immunosuppressieve moleculen te onderscheppen en hun effect af te schaffen, of om activerende routes te stimuleren, of, alternatief, om remmende receptoren te blokkeren. Genexpressieanalyse evenals flowcytometrie, het meten van de cytotoxische korrels en cytokines die worden afgegeven uit cytotoxische cellen, zullen worden gebruikt om de NK- en T -celfunctie te beoordelen.