個別化オンコ血液学のための精密身体運動 (PEPOH)

PEPOHプロジェクトの主な目的は、治療耐性、疾患進行、全生存期間に関連するシグネチャを決定するために、マルチオミクスデータセットの網羅的かつ体系的な統合を通じて、患者（積極的治療中および／または治療プロセス中）における固形および／または血液腫瘍に対する強度トレーニングへの臨床反応を特徴づけ、予測することです。

この主な目標から、いくつかの具体的な目的が導き出されます：

1. - 次世代シーケンシング（RNA、SNPs、CHIP）、プロテオミクス、メタボロミクスによる末梢血の差異分子プロファイルを解読することで、運動が患者に及ぼす影響の包括的分析のための新たな知見を提供し、身体運動の免疫調節効果を決定する

2. - がん血液疾患患者における身体運動プログラムの、全体的な生活の質に関連する内的能力の多面的指標への影響を評価する：

   1. - 機能的体力（筋力、歩行速度、バランス、疲労）。
   2. - 心理的ウェルビーイングと精神的健康。
   3. - 体組成と人体計測変数。

   4. - 睡眠の質、全体的な生活の質、がん関連の生活の質。

      これらすべての目的は、現在の腫瘍学における3つの主要な優先事項に対応しています：

      1. 運動の治療効果の根底にある生理学的および分子的メカニズムを理解すること。
      2. 血液がん患者など、非常に脆弱で過小評価されている集団において、堅牢なエビデンスを生成すること。
      3. がんの臨床管理において、強度トレーニングを標準化された補助的介入として組み込むための基盤を確立すること。

      PEPOHの付加価値は、基礎科学と臨床実践、分子生物学と運動生理学、マルチオミクス分析と包括的患者評価を組み合わせた、トランスレーショナルで学際的なアプローチにあります。 この枠組みを通じて、プロジェクトは、生存率、ウェルビーイング、生活の質を改善できる個別化された治療ツールとして身体運動を統合することにより、腫瘍学ケアにおけるパラダイムシフトに貢献することを目指しています。

      PEPOHプロジェクトの学際的側面を念頭に置いて、強度トレーニング下にあるがん血液疾患患者のマルチオミクス特性評価によって得られる分子指紋は、治療耐性と生存に関連するため、その治療的使用の生物学的基盤を提供する資産となります。 さらに、これらの分子シグネチャは、炎症調節、エネルギー代謝、腫瘍免疫、筋可塑性、老化、虚弱性に関する新たな生物学的知見を提供する可能性があります。 これらすべての発見により、研究者は運動後に観察される機能的および情緒的改善を説明するメカニズムを解読することが可能になります。

      さらに、十分に特徴づけられ定義された患者コホートの詳細なマルチオミクス特性評価は、さらなる生物医学的研究に非常に有用であり、科学界の参照基準となる可能性のある新規データセットを提供します。

      臨床的観点からは、分子的および臨床的データセットの体系的かつ正確な統合により、各患者と腫瘍に対する運動介入の有効性を評価するのに役立つ予測反応モデルの開発が可能になり、これは精密運動と呼ばれます。

      要約すると、PEPOHプロジェクトは、がん患者に対する包括的アプローチの中で、個別化され費用対効果の高い補助的介入として運動を組み込むことを支持するトランスレーショナルなエビデンスを提供し、精密腫瘍学の発展に貢献します。

      研究デザイン PEPOHは、無作為化比較臨床試験です。 研究は、FIBSALの技術的および科学的支援を受けて、サラマンカ大学病院で実施されます。

      対象集団

      試験には、以下の診断に対応する5つの患者コホートが含まれます：肺がん、大腸がん、乳がん、慢性リンパ性白血病、多発性骨髄腫。 各コホートは50名の患者で構成され、総サンプル数は250名となります。 ベースライン評価後、患者は無作為に（1:1）2つの研究グループのいずれかに割り付けられます：

      監督介入群：専門家の監督下で週2回、12週間実施される強度トレーニングプログラムで、在宅運動プログラムが補完されます。

      対照群：監督群と同じ推奨事項とガイドラインに従う在宅運動プログラムですが、監督付きの対面セッションはありません。

      評価は、ベースライン時と12週間の介入後に行われ、6か月後に追加のフォローアップが行われ、中期的な臨床的および分子的効果の持続性を分析します。

      参加基準：

      • 成人患者（年齢≧18歳）、インフォームドコンセントに署名でき、研究への参加を希望する者。
      • Performance status (ECOG) 0-2。

      研究に参加する各コホートに対して、以下のように具体的な参加基準が定義されています：

      肺がん：転移性ステージの非小細胞肺がんと診断され、併用免疫療法と化学療法の適応があり、積極的治療中の患者。

      大腸がん：ステージII、III、またはIVの切除大腸がんで、補助化学療法を受けている患者。

      乳がん：ホルモン受容体陽性／HER2陰性乳がんと組織学的に確認された女性患者で、補助療法または安定した転移性段階において積極的ホルモン療法（タモキシフェン、アロマターゼ阻害剤、またはフルベストラント）を受けている者。

      慢性リンパ性白血病（CLL）：CLLと診断され、薬物治療を受けておらず、必要としていない患者。

      多発性骨髄腫（MM）：新たにMMと確認された診断で、積極的第一線治療中であり、自家移植の対象ではない患者。

      除外基準：

      不安定な骨転移または骨折の高いリスクに関連する広範な骨病変の存在。

      研究責任医師の判断により、身体運動を禁忌とする制御されていない心血管、呼吸器、筋骨格、または代謝性疾患。

      運動トレーニングに対する明示的な医学的禁忌。 文書化された低い遵守率（＜80%）。 治療中止、疾患進行、不耐性、または研究責任医師の意見において、参加者の安全性または研究の完全性を損なう可能性のあるその他の医学的、個人的、またはロジスティックな状況。

      サンプルサイズ 研究のサンプルサイズを評価するために、個人間因子（対照群と介入群）と個人内因子（事前事後および6か月フォローアップ）を持つ2要因ANOVAデザインが選択されました。 効果量f=0.20、有意水準5%、検出力80%、反復測定間の相関0.5を考慮すると、必要な総サンプルサイズは42となります。 2つの実験群間で20%の追跡不能が発生する可能性があると推定されるため、コホートごとの総サンプルサイズは50名としています。

      方法論 研究の生物学的サンプル 末梢血サンプル（10 mL EDTAチューブ1本）は、3つの時点で収集されます：1）プログラム開始前；2）12週間の介入後；3）6か月フォローアップ時。 単離された末梢血単核球（PBMCs）、血清、血漿は、IBSALバイオバンクで標準化された条件下で適切に保存されます。

      プロテオミクス特性評価 血漿の定量的プロテオミクス分析をPreOmics® ENRICHplus技術により行い、その後、液体クロマトグラフィーとイオン移動度分光法（LC-IMS/MS）を組み合わせることで、最小血漿量（50µL）からの再現性が高く高感度な分析が可能になります。

      溶出ペプチドの定量的プロテオミクス分析は、LC Evosep Oneシステム（Evosep Biosystems、デンマーク）とMS timsTOF Pro 2（Bruker Corporation、米国）を結合し、60サンプル/日の分離法を用いて実施されます。 DIA-PASEFアプローチが適用され、質量/電荷範囲100〜1700、イオン移動度範囲0.85-1.30 1/K0、サイクルタイム100msで行われます。

      免疫表現型解析 免疫集団分析（目的1）のために、研究者はCD45、CD3、CD4、CD8、CD5、CD7、TCR、CD27、CD45RA、CD127、CD25RA、CD56、HLA-DR、CD11c、CD123、CD33、CD14、CD16に対する抗体を含むパネルを使用し、最低50万イベントを取得します。 このパネルにより、Tリンパ球、NK細胞、樹状細胞、単球の異なるサブ集団の同定が可能になります。 B細胞分析には、EuroFlowで説明されているLSTスクリーニング戦略を採用します。 すべての分析は、8色FACScantoサイトメーターとInfinicytソフトウェアを使用して実施されます。 すべてのサンプルは、サラマンカ大学の一般フローサイトメトリーサービス（www.nucleus.usal.es）および血液学科で処理されます。

      メタボロミクスプロファイリング 血漿タンパク質をメタノールで沈殿させ、SPEでグリセロリン脂質を抽出します。 濾過後、各溶液をD₂Oで600 µLに調整し、5 mm NMRチューブに移します。 NMR分析は、クライオプローブを備えたBruker Avance Neo 400 MHz分光計で298 Kで実施されます。 パラメータは、Chenomx NMR Suite 10（Chenomx、エドモントン、カナダ）を使用して代謝物定量用に最適化されます。 代謝物の同定と定量は、複雑なスペクトルにおける信頼性の高いデコンボリューションと濃度決定を可能にするこのソフトウェアで実施されます。 プロトンピークの割り当ては、化学シフトをヒトメタボロームデータベース（http://www.hmdb.ca）と比較することでさらに検証されます。

      トランスクリプトミクスおよびゲノム解析 cfRNAおよびDNA抽出 血漿cfRNA抽出は、低収量および短いRNAフラグメントに最適化されたmiRNeasy Serum/Plasma Advanced Kit（Qiagen）を使用して実施されます。 RNA濃度と純度は、Qubit RNA HS Assay（Invitrogen）を用いて蛍光光度法で決定されます。血漿ctDNAは、QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit（Qiagen、ヒルデン、ドイツ）を使用して抽出されます。 ゲノムDNA（gDNA）は、標準プロトコルに従ってQIAamp DNA Blood Midi Kit（Qiagen、ドイツ）を使用して末梢血から単離されます。

      ライブラリー調製およびシーケンシング cfRNAライブラリーは、低RNA入力および短いフラグメントに最適化されたQiagen QIAseq cfRNA All-in-One Kitを使用して生成されます。 シーケンシングはNovaSeq Xシーケンサー（Illumina、サンディエゴ、米国）で実施され、低存在量転写産物の検出を最大化するために、平均深度5,000万リード以上の150bpペアエンドリード（2×150bp）を生成します。

      ctDNAおよびgDNAライブラリー調製とシーケンシングは、SureSelect V6キャプチャキット（Agilent、サンタクララ、米国）およびIllumina技術（NovaSeq 6000、150PE 2×150bp）を使用して実施され、サンプルあたり平均シーケンシング深度18Gbに達します。

      バイオインフォマティクス解析 シーケンシングから得られたFASTQファイルの品質は、FastQC（Quality Control Tool for High Throughput Sequence Data）で評価されます。 生リードはFastQCとMultiQCで品質管理され、その後、Trimmomaticを使用してアダプターのトリミングと低品質リードの除去が行われます。 ヒト参照ゲノム（GRCh38）へのアラインメントはSTAR（v2.7）で実施され、遺伝子量はfeatureCounts（Subreadパッケージ）を使用して定量化されます。 正規化および発現差解析はDESeq2（Bioconductor）を使用して実施され、調整済みp値＜0.05を有意性の閾値として適用します。 機能および経路エンリッチメント解析は、clusterProfiler、GOplot、GSEAを使用して実施されます。 発現差遺伝子は、逆転写および定量的リアルタイムPCRによって検証されます。

      ゲノム解析 ペアエンドリードは、BWA-MEM（v0.7.17）を使用してヒトゲノム（GRCh37）にアラインメントされます。 得られたSAMファイルは、MarkDuplicatesSpark（GATK）を使用した重複除去を含む下流解析の効率を改善するために処理されます。 塩基品質スコアの再較正は、BaseRecalibratorとApplyBQSR（GATK）を使用して実施されます。 体細胞変異コーリングはMutect2（GATK、ペアモード）で実施され、その後FilterMutectCallsを使用したフィルタリングが行われます。 生殖細胞系変異（SNVおよびINDEL）はHaplotypeCallerで同定され、ハードフィルターを使用してフィルタリングされます。 選択された変異はFuncotatorでアノテーションされ、変異病原性はVarank（v1.4.3）で評価されます。 検出されたSNVおよびINDELの頻度と分布は、ANNOVARを使用して健康ドナーデータベース（NHLBI-ESPおよびgnomAD）と比較されます。

      マルチオミクス統合 オミクスデータは、IBSALバイオインフォマティクスユニットによって開発されたパイプラインを使用して統合されます。 機械学習ツール（ランダムフォレスト、SVM）およびネットワーク分析（Weighted Gene Co-expression Network Analysis、WGCNA）を適用して、共通および腫瘍タイプ特異的な分子パターンを同定します。 Multi-OMics-Factor Analysis（MOFA）。 マルチオミクスデータと臨床データの統合により、身体運動への反応の予測モデルの開発が可能になります。

      臨床的、機能的、および心理的評価 すべての臨床的および機能的アウトカムは、3つの時点で収集されます：1）プログラム開始前、2）12週間の介入後、3）6か月フォローアップ時。

      すべての場合において、すべての個人が評価されます：筋力（ダイナモメトリー）、体組成（Tanita BC-418）、機能的状態（Short Physical Performance Battery）、生活の質（EORTC QLQ-C30）、心理的ウェルビーイング（Hospital anxiety and depression scale）、睡眠の質（Athens Insomnia scale）、身体活動レベル（International Physical Activity Questionnaire）。

      介入 両群（強度トレーニングプログラムおよび在宅運動プログラム）の介入の詳細は、公表された研究プロトコルに記載されています。