Esercizio Fisico di Precisione per l'Onco-Ematologia Personalizzata. (PEPOH)

L'obiettivo principale del progetto PEPOH è caratterizzare e prevedere la risposta clinica all'allenamento di forza in pazienti con tumori solidi e/o ematologici (in terapia attiva e/o durante il processo terapeutico) attraverso un'integrazione esaustiva e sistematica di dataset multi-omici per determinare firme associate alla tolleranza al trattamento, alla progressione della malattia e alla sopravvivenza globale.

Da questo obiettivo principale derivano diversi obiettivi specifici:

1. - Determinare l'effetto immunomodulatore dell'esercizio fisico decifrando i profili molecolari differenziali nel sangue periferico mediante sequenziamento di nuova generazione (RNA, SNPs, CHIP), proteomica e metabolomica, che forniscono nuove intuizioni per un'analisi completa dell'effetto dell'esercizio sui pazienti.

2. - Valutare l'impatto di un programma di esercizio fisico in pazienti oncoematologici su indicatori multidimensionali della loro capacità intrinseca correlata alla qualità della vita complessiva:

   1. - Condizione fisica funzionale (forza muscolare, velocità di camminata, equilibrio e fatica).
   2. - Benessere psicologico e salute mentale.
   3. - Composizione corporea e variabili antropometriche.

   4. - Qualità del sonno, qualità della vita complessiva e qualità della vita correlata al cancro.

      Tutti questi obiettivi rispondono a tre priorità principali nell'oncologia attuale:

      1. Comprendere i meccanismi fisiologici e molecolari alla base degli effetti terapeutici dell'esercizio.
      2. Generare prove robuste in popolazioni altamente vulnerabili e sottorappresentate, come i pazienti con tumori ematologici.
      3. Stabilire le basi per incorporare l'allenamento di forza come un'intervento adiuvante standardizzato nella gestione clinica del cancro.

      Il valore aggiunto di PEPOH risiede nel suo approccio traslazionale e multidisciplinare, che combina scienza di base con pratica clinica, biologia molecolare con fisiologia dell'esercizio e analisi multi-omica con valutazione completa del paziente. Attraverso questo quadro, il progetto mira a contribuire a un cambio di paradigma nell'assistenza oncologica integrando l'esercizio fisico come strumento terapeutico personalizzato in grado di migliorare la sopravvivenza, il benessere e la qualità della vita nelle persone con cancro.

      Tenendo presente l'aspetto multidisciplinare del progetto PEPOH, l'impronta molecolare -ottenuta dalla caratterizzazione multi-omica- dei pazienti oncoematologici sottoposti ad allenamento di forza sarà una risorsa per fornire la base biologica del suo uso terapeutico, poiché è correlata alla tolleranza al trattamento e alla sopravvivenza. Inoltre, queste firme molecolari potrebbero fornire nuove intuizioni biologiche nella regolazione dell'infiammazione, nel metabolismo energetico, nell'immunità tumorale, nella plasticità muscolare, nell'invecchiamento e nella fragilità. Tutti questi risultati consentiranno ai ricercatori di decifrare i meccanismi che spiegano il miglioramento funzionale ed emotivo osservato dopo l'esercizio.

      Inoltre, la profonda caratterizzazione multi-omica di una coorte di pazienti ben caratterizzata e definita fornirà nuovi dataset, che potrebbero essere molto utili per ulteriori studi biomedici e un riferimento per la comunità scientifica.

      Da un punto di vista clinico, l'integrazione sistematica e accurata dei dataset molecolari e clinici consentirà lo sviluppo di modelli predittivi di risposta che aiutano a valutare l'efficacia degli interventi di esercizio per ciascun paziente e tumore, denominato esercizio di precisione.

      In sintesi, il progetto PEPOH fornirà prove traslazionali per supportare l'incorporazione dell'esercizio come intervento adiuvante personalizzato e costo-efficace nell'approccio completo ai pazienti con cancro, contribuendo allo sviluppo dell'oncologia di precisione.

      Disegno dello studio PEPOH è uno studio clinico randomizzato e controllato. Lo studio sarà condotto presso l'Ospedale Universitario di Salamanca, con il supporto tecnico e scientifico di FIBSAL.

      Popolazione

      Lo studio includerà cinque coorti di pazienti corrispondenti alle seguenti diagnosi: cancro del polmone, cancro del colon-retto, cancro al seno, leucemia linfatica cronica e mieloma multiplo. Ogni coorte sarà composta da 50 pazienti, per un campione totale di 250 pazienti. Dopo una valutazione basale, i pazienti saranno assegnati in modo casuale (1:1) a uno dei due gruppi di studio:

      Gruppo di intervento supervisionato: un programma di allenamento di forza condotto due volte a settimana per 12 settimane sotto supervisione professionale, integrato da un programma di esercizi a domicilio.

      Gruppo di controllo: un programma di esercizi a domicilio che segue le stesse raccomandazioni e linee guida del gruppo supervisionato ma senza sessioni supervisionate di persona.

      Le valutazioni saranno effettuate al basale e dopo l'intervento di 12 settimane, con un ulteriore follow-up a 6 mesi per analizzare la persistenza degli effetti clinici e molecolari a medio termine.

      Criteri di inclusione:

      • Pazienti adulti (≥18 anni), in grado di firmare il consenso informato e disposti a partecipare allo studio.
      • Performance status (ECOG) 0-2.

      Criteri di inclusione specifici sono definiti per ciascuna coorte coinvolta nello studio come segue:

      Cancro del polmone: Pazienti con diagnosi di carcinoma polmonare non a piccole cellule in stadio metastatico, eleggibili per immunoterapia e chemioterapia combinata, in trattamento attivo.

      Cancro del colon-retto: Pazienti con cancro del colon-retto in stadio II, III o IV resecato sottoposti a chemioterapia adiuvante.

      Cancro al seno: Pazienti di sesso femminile con cancro al seno positivo ai recettori ormonali/HER2-negativo confermato istologicamente, in terapia ormonale attiva (tamoxifene, inibitore dell'aromatasi o fulvestrant) in fase adiuvante o metastatica stabile.

      Leucemia linfatica cronica (LLC): Pazienti con diagnosi di LLC che non hanno ricevuto e non necessitano di trattamento farmacologico.

      Mieloma multiplo (MM): Pazienti con una nuova diagnosi confermata di MM in trattamento attivo di prima linea e non candidati al trapianto autologo.

      Criteri di esclusione:

      Presenza di metastasi ossee instabili o esteso coinvolgimento osseo associato ad alto rischio di frattura.

      Malattie cardiovascolari, respiratorie, muscoloscheletriche o metaboliche non controllate che controindicano l'esercizio fisico a discrezione dello sperimentatore.

      Controindicazione medica esplicita all'allenamento fisico. Scarsa aderenza documentata (<80%). Interruzione del trattamento, progressione della malattia, intolleranza o qualsiasi altra circostanza medica, personale o logistica che, a giudizio degli sperimentatori, possa compromettere la sicurezza dei partecipanti o l'integrità dello studio.

      Dimensione del campione È stato scelto un disegno ANOVA a due fattori con un fattore tra individui (gruppi di controllo e intervento) e un fattore entro individui (pre-post e follow-up a sei mesi) per valutare la dimensione del campione dello studio. La dimensione totale del campione richiesta sarebbe di 42, considerando una dimensione dell'effetto di f=0.20, un livello di significatività del 5%, una potenza dell'80% e una correlazione tra misure ripetute di 0.5. Si stima che possa esserci una perdita al follow-up del 20% tra i due gruppi sperimentali, e quindi la dimensione totale del campione è di 50 individui per coorte.

      Metodologia Campioni biologici dello studio Campioni di sangue periferico (una provetta EDTA da 10 mL) saranno raccolti in tre momenti: 1) prima di iniziare il programma; 2) dopo 12 settimane di intervento; 3) follow-up a 6 mesi. Cellule mononucleate del sangue periferico isolate (PBMCs), siero e plasma, che saranno adeguatamente conservati nella biobanca IBSAL in condizioni standardizzate.

      Caratterizzazione Proteomica Analisi proteomica quantitativa del plasma mediante tecnologia PreOmics® ENRICHplus, seguita da cromatografia liquida accoppiata a spettrometria di mobilità ionica (LC-IMS/MS), che consentirà un'analisi riproducibile e altamente sensibile da un volume minimo di plasma (50µL). L'analisi proteomica quantitativa dei peptidi eluiti sarà eseguita su un sistema LC Evosep One (Evosep Biosystems, Danimarca), accoppiato a un MS timsTOF Pro 2 (Bruker Corporation, USA), utilizzando un metodo di separazione di 60 campioni/giorno. Verrà applicato un approccio DIA-PASEF con un intervallo massa/carica da 100 a 1700 e un intervallo di mobilità ionica di 0.85-1.30 1/K0, con un tempo di ciclo di 100ms.

      Immunofenotipizzazione Per le analisi delle popolazioni immunitarie (obiettivo 1), i ricercatori utilizzeranno un pannello che include anticorpi contro CD45, CD3, CD4, CD8, CD5, CD7, TCR, CD27, CD45RA, CD127, CD25RA, CD56, HLA-DR, CD11c, CD123, CD33, CD14 e CD16 con un'acquisizione minima di 500.000 eventi. Questo pannello consentirà l'identificazione di diverse sottopopolazioni di linfociti T, cellule NK, cellule dendritiche e monociti. Per l'analisi delle cellule B, impiegheremo la strategia di screening LST come descritto da EuroFlow. Tutte le analisi saranno eseguite utilizzando un citometro FACScanto a 8 colori e il software Infinicyt. Tutti i campioni saranno processati presso il Servizio Generale di Citometria a Flusso dell'Università di Salamanca (www.nucleus.usal.es) e presso il Dipartimento di Ematologia.

      Profilazione Metabolomica Le proteine plasmatiche saranno precipitate con metanolo e i glicerofosfolipidi estratti mediante SPE. Dopo la filtrazione, ogni soluzione sarà portata a 600 µL con D₂O e trasferita in tubi NMR da 5 mm. Le analisi NMR saranno eseguite a 298 K su uno spettrometro Bruker Avance Neo 400 MHz con criosonda. I parametri saranno ottimizzati per la quantificazione dei metaboliti utilizzando Chenomx NMR Suite 10 (Chenomx, Edmonton, Canada). L'identificazione e la quantificazione dei metaboliti saranno eseguite con questo software, che consente una deconvoluzione affidabile e la determinazione della concentrazione in spettri complessi. Le assegnazioni dei picchi di protoni saranno ulteriormente validate confrontando gli spostamenti chimici con l'Human Metabolome Database (http://www.hmdb.ca).

      Analisi Trascrittomica e Genomica Estrazione di cfRNA e DNA L'estrazione di cfRNA plasmatico sarà eseguita utilizzando il kit miRNeasy Serum/Plasma Advanced Kit (Qiagen), ottimizzato per bassa resa e frammenti di RNA corti. La concentrazione e la purezza dell'RNA saranno determinate fluorometricamente utilizzando il saggio Qubit RNA HS (Invitrogen). Il ctDNA plasmatico sarà estratto utilizzando il kit QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit (Qiagen, Hilden, Germania). Il DNA genomico (gDNA) sarà isolato dal sangue periferico utilizzando il kit QIAamp DNA Blood Midi Kit (Qiagen, Germania) seguendo protocolli standard.

      Preparazione delle Librerie e Sequenziamento Le librerie di cfRNA saranno generate utilizzando il kit Qiagen QIAseq cfRNA All-in-One Kit, ottimizzato per basso input di RNA e frammenti corti. Il sequenziamento sarà eseguito su un sequenziatore NovaSeq X (Illumina, San Diego, CA, USA), producendo letture paired-end di 150bp (2×150bp) con una profondità media superiore a 50 milioni di letture per massimizzare il rilevamento di trascritti a bassa abbondanza.

      La preparazione e il sequenziamento delle librerie di ctDNA e gDNA saranno condotti utilizzando il kit di cattura SureSelect V6 (Agilent, Santa Clara, CA, USA) e la tecnologia Illumina (NovaSeq 6000, 150PE 2×150bp), raggiungendo una profondità media di sequenziamento di 18Gb/campione.

      Analisi Bioinformatica La qualità dei file FASTQ ottenuti dal sequenziamento sarà valutata con FastQC (Quality Control Tool for High Throughput Sequence Data). Le letture grezze subiranno un controllo di qualità con FastQC e MultiQC, seguito dalla rimozione degli adattatori e delle letture di bassa qualità utilizzando Trimmomatic. L'allineamento al genoma di riferimento umano (GRCh38) sarà eseguito con STAR (v2.7) e l'abbondanza genica quantificata utilizzando featureCounts (pacchetto Subread). La normalizzazione e l'analisi dell'espressione differenziale saranno eseguite utilizzando DESeq2 (Bioconductor), applicando p-values aggiustati <0.05 come soglia di significatività. Le analisi di arricchimento funzionale e di pathway saranno condotte con clusterProfiler, GOplot e GSEA. I geni differenzialmente espressi saranno validati mediante trascrizione inversa e PCR quantitativa in tempo reale.

      Analisi Genomica Le letture paired-end saranno allineate al genoma umano (GRCh37) utilizzando BWA-MEM (v0.7.17). I file SAM risultanti saranno elaborati per migliorare l'efficienza delle analisi successive, inclusa la rimozione dei duplicati utilizzando MarkDuplicatesSpark (GATK). La ricalibrazione del punteggio di qualità delle basi sarà eseguita con BaseRecalibrator e ApplyBQSR (GATK). La chiamata delle varianti somatiche sarà condotta con Mutect2 (GATK, modalità paired), seguita dal filtraggio utilizzando FilterMutectCalls. Le varianti germinali (SNVs e INDELs) saranno identificate con HaplotypeCaller e filtrate utilizzando filtri rigidi. Le varianti selezionate saranno annotate con Funcotator e la patogenicità delle varianti valutata con Varank (v1.4.3). La frequenza e la distribuzione degli SNVs e INDELs rilevati saranno confrontate con database di donatori sani (NHLBI-ESP e gnomAD) utilizzando ANNOVAR.

      Integrazione Multi-Omica I dati omici saranno integrati utilizzando pipeline sviluppate dall'Unità di Bioinformatica di IBSAL. Strumenti di machine learning (Random Forest, SVM) e analisi di rete (Weighted Gene Co-expression Network Analysis, WGCNA) saranno applicati per identificare pattern molecolari comuni e specifici del tipo di tumore. Analisi Fattoriale Multi-OMica (MOFA). L'integrazione dei dati multi-omici e clinici consentirà lo sviluppo di modelli predittivi di risposta all'esercizio fisico.

      Valutazioni Cliniche, Funzionali e Psicologiche Tutti gli esiti clinici e funzionali saranno raccolti in tre momenti: 1) prima di iniziare il programma, 2) dopo 12 settimane di intervento, 3) follow-up a 6 mesi. In tutti i casi, tutti gli individui saranno valutati: Forza muscolare (Dinamometria), composizione corporea (Tanita BC-418), stato funzionale (Short Physical Performance Battery), qualità della vita (EORTC QLQ-C30), benessere psicologico (Hospital anxiety and depression scale), qualità del sonno (Athens Insomnia scale), livello di attività fisica (International Physical Activity Questionnaire).

      Intervento L'intervento di entrambi i gruppi (programma di allenamento di forza e programma di esercizi a domicilio) è dettagliato nei protocolli di studio pubblicati.