Presis fysisk trening for personlig onko-hematologi. (PEPOH)

Hovedmålet med PEPOH-prosjektet er å karakterisere og forutsi klinisk respons på styrketrening ved solide og/eller hematologiske svulster hos pasienter (under aktiv behandling og/eller i løpet av behandlingsprosessen) gjennom en grundig og systematisk integrasjon av multi-omiske datasett for å bestemme signaturer assosiert med behandlingstoleranse, sykdomsprogresjon og total overlevelse.

Flere spesifikke mål følger av dette hovedmålet:

1. - Bestemme den immunmodulerende effekten av fysisk trening ved å dechiffrere differensielle molekylære profiler i perifert blod ved hjelp av neste-generasjons sekvensering (RNA, SNPs, CHIP), proteomikk og metabolomikk, som gir nye innsikter for en omfattende analyse av treningens effekt på pasienter.

2. - Evaluere påvirkningen av et fysisk treningsprogram hos onkohematologiske pasienter på multidimensjonale indikatorer for deres iboende kapasitet relatert til total livskvalitet:

   1. - Funksjonell fysisk tilstand (muskelstyrke, ganghastighet, balanse og tretthet).
   2. - Psykologisk velvære og mental helse.
   3. - Kroppssammensetning og antropometriske variabler.

   4. - Søvnkvalitet, total livskvalitet og kreftrelatert livskvalitet.

      Alle disse målene svarer til tre hovedprioriteter i dagens onkologi:

      1. å forstå de fysiologiske og molekylære mekanismene som ligger til grunn for treningens terapeutiske effekter.
      2. å generere robuste bevis i svært sårbare og underrepresenterte populasjoner, som hematologiske kreftpasienter.
      3. å etablere grunnlaget for å inkorporere styrketrening som en standardisert adjuvansintervensjon innen klinisk kreftbehandling.

      Den ekstra verdien av PEPOH ligger i dens translasjonelle og tverrfaglige tilnærming, som kombinerer grunnleggende vitenskap med klinisk praksis, molekylærbiologi med treningsfysiologi, og multi-omisk analyse med omfattende pasientvurdering. Gjennom dette rammeverket tar prosjektet sikte på å bidra til et paradigmeskifte i onkologisk omsorg ved å integrere fysisk trening som et personlig tilpasset terapeutisk verktøy i stand til å forbedre overlevelse, velvære og livskvalitet hos personer med kreft.

      Med tanke på det tverrfaglige aspektet ved PEPOH-prosjektet, vil det molekylære fingeravtrykket - oppnådd gjennom multi-omisk karakterisering - av onkohematologiske pasienter under styrketrening være en ressurs for å gi den biologiske grunnlaget for dets terapeutiske bruk, ettersom det er relatert til behandlingstoleranse og overlevelse. I tillegg kan disse molekylære signaturer gi nye biologiske innsikter i inflammasjonsregulering, energimetabolisme, tumorimmunitet, muskelplastisitet, aldring og skrøpelighet. Alle disse funnene vil gjøre det mulig for forskerne å dechiffrere mekanismer som forklarer den funksjonelle og emosjonelle forbedringen observert etter trening.

      Dessuten vil den dype multi-omiske karakteriseringen av en velkarakterisert og definert kohort av pasienter gi nye datasett, som kan være svært nyttige for videre biomedisinske studier og en referanse for det vitenskapelige samfunnet.

      Fra et klinisk synspunkt vil den systematiske og nøyaktige integrasjonen av molekylære og kliniske datasett muliggjøre utvikling av prediktive responsmodeller som hjelper til med å evaluere effektiviteten av treningsintervensjoner for hver pasient og tumor, kalt presisjonstrening.

      Oppsummert vil PEPOH-prosjektet gi translasjonelle bevis for å støtte inkorporeringen av trening som en personlig tilpasset og kostnadseffektiv adjuvansintervensjon innen den helhetlige tilnærmingen til pasienter med kreft, og bidra til utviklingen av presisjonsonkologi.

      Studiedesign PEPOH er en randomisert, kontrollert klinisk studie. Studien vil bli utført ved Salamanca University Hospital, med teknisk og vitenskapelig støtte fra FIBSAL.

      Populasjon

      Studien vil inkludere fem pasientkohorter som tilsvarer følgende diagnoser: lungekreft, kolorektal kreft, brystkreft, kronisk lymfatisk leukemi og multipelt myelom. Hver kohort vil bestå av 50 pasienter, noe som resulterer i et totalt utvalg på 250 pasienter. Etter en basislinjevurdering vil pasientene bli tilfeldig tildelt (1:1) til en av to studiegrupper:

      Supervisert intervensjonsgruppe: et styrketreningsprogram utført to ganger i uken i 12 uker under profesjonell veiledning, supplert med et hjemmebasert treningsprogram.

      Kontrollgruppe: et hjemmebasert treningsprogram som følger de samme anbefalingene og retningslinjene som den superviserte gruppen, men uten superviserte personlige økter.

      Vurderinger vil bli utført ved basislinje og etter 12 ukers intervensjon, med en ekstra oppfølging etter 6 måneder for å analysere vedvaren av kliniske og molekylære effekter på mellomlang sikt.

      Inklusjonskriterier:

      • Voksne pasienter (≥18 år), i stand til å signere informert samtykke og villige til å delta i studien.
      • Ytelsestatus (ECOG) 0-2.

      Spesifikke inklusjonskriterier er definert for hver kohort involvert i studien som følger:

      Lungekreft: Pasienter diagnostisert med ikke-småcellet lungekarsinom i metastatisk stadium, kvalifisert for kombinert immunterapi og kjemoterapi, med aktiv behandling.

      Kolorektal kreft: Pasienter med stadium II, III eller IV resekert kolorektal kreft som gjennomgår adjuvans kjemoterapi.

      Brystkreft: Kvinnelige pasienter med histologisk bekreftet hormonreseptor-positiv/HER2-negativ brystkreft, som mottar aktiv hormonell behandling (tamoksifen, aromatasehemmer eller fulvestrant) i enten adjuvans eller stabil metastatisk fase.

      Kronisk lymfatisk leukemi (CLL): Pasienter diagnostisert med CLL som ikke har mottatt og ikke trenger farmakologisk behandling.

      Multippelt myelom (MM): Pasienter med en bekreftet ny diagnose av MM under aktiv første linje behandling og ikke kandidater til autolog transplantasjon.

      Eksklusjonskriterier:

      Tilstedeværelse av ustabile beinmetastaser eller omfattende beinengasjement assosiert med høy risiko for brudd.

      Ukontrollerte kardiovaskulære, respiratoriske, muskuloskeletale eller metabolske sykdommer som kontraindicerer fysisk trening etter forskerens skjønn.

      Eksplisitt medisinsk kontraindikasjon mot trening. Dokumentert dårlig adherence (<80%). Behandlingsstans, sykdomsprogresjon, intoleranse eller enhver annen medisinsk, personlig eller logistisk omstendighet som etter forskernes mening kan kompromittere deltakers sikkerhet eller studiens integritet.

      Utvalgsstørrelse En to-faktor ANOVA-design med en mellom-individ faktor (kontroll- og intervensjonsgrupper) og en innenfor-individ faktor (pre-post og seks-måneders oppfølging) ble valgt for å evaluere utvalgsstørrelsen for studien. Den totale utvalgsstørrelsen som kreves ville være 42, med tanke på en effektstørrelse på f=0,20, et signifikansnivå på 5%, en styrke på 80% og en korrelasjon mellom gjentatte målinger på 0,5. Det estimeres at det kan være et 20% frafall mellom de to eksperimentelle gruppene, og derfor er den totale utvalgsstørrelsen 50 individer per kohort.

      Metodologi Biologiske prøver fra studien Perifere blodprøver (ett 10 mL EDTA-rør) vil bli samlet inn på tre tidspunkt: 1) før programmet starter; 2) etter 12 uker med intervensjon; 3) 6-måneders oppfølging. Isolerte perifere blod mononukleære celler (PBMCs), serum og plasma, som vil bli korrekt oppbevart ved IBSAL-biobanken under standardiserte forhold.

      Proteomisk karakterisering Kvantitativ proteomisk analyse av plasma ved PreOmics® ENRICHplus-teknologi, etterfulgt av væskekromatografi koblet med ionemobilitetsspektrometri (LC-IMS/MS), som vil tillate reproduserbar og svært følsom analyse fra et minimum plasma-volum (50µL). Kvantitativ proteomisk analyse av de eluerte peptidene vil bli utført på et LC Evosep One-system (Evosep Biosystems, Danmark), koblet til en MS timsTOF Pro 2 (Bruker Corporation, USA), ved bruk av en separasjonsmetode på 60 prøver/dag. En DIA-PASEF-tilnærming vil bli brukt med en masse/ladningsrekkevidde på 100 til 1700 og en ionemobilitetsrekkevidde på 0,85-1,30 1/K0, med en syklustid på 100 ms.

      Immunfenotyping For immunpopulasjonsanalyser (mål 1), vil forskerne bruke et panel inkludert antistoffer mot CD45, CD3, CD4, CD8, CD5, CD7, TCR, CD27, CD45RA, CD127, CD25RA, CD56, HLA-DR, CD11c, CD123, CD33, CD14 og CD16 med et minimum innhenting av 500 000 hendelser. Dette panelet vil tillate identifikasjon av forskjellige subpopulasjoner av T-lymfocytter, NK-celler, dendrittiske celler og monocytter. For B-celleanalyse vil vi bruke LST-screeningstrategien som beskrevet av EuroFlow. Alle analysene vil bli utført ved bruk av en 8-fargers FACScanto-sytometer og Infinicyt-programvare. Alle prøver vil bli prosessert ved General Flow Cytometry Service ved University of Salamanca (www.nucleus.usal.es) og ved Hematologiavdelingen.

      Metabolomikkprofilering Plasmaproteiner vil bli utfelt med metanol, og glyserofosfolipider ekstrahert ved SPE. Etter filtrering vil hver løsning justeres til 600 µL med D₂O og overført til 5 mm NMR-rør. NMR-analyser vil bli utført ved 298 K på en Bruker Avance Neo 400 MHz spektrometer med en kryoprobe. Parametere vil bli optimalisert for metabolittkvantifisering ved bruk av Chenomx NMR Suite 10 (Chenomx, Edmonton, Canada). Metabolittidentifikasjon og kvantifisering vil bli utført med denne programvaren, som muliggjør pålitelig dekonvolusjon og konsentrasjonsbestemmelse i komplekse spektra. Proton-topp-tilordninger vil bli ytterligere validert ved å sammenligne kjemiske skift med Human Metabolome Database (http://www.hmdb.ca).

      Transkriptomisk og genomisk analyse cfRNA og DNA-ekstraksjon Plasma cfRNA-ekstraksjon vil bli utført ved bruk av miRNeasy Serum/Plasma Advanced Kit (Qiagen), optimalisert for lav utbytte og korte RNA-fragmenter. RNA-konsentrasjon og renhet vil bli bestemt fluorometrisk ved bruk av Qubit RNA HS Assay (Invitrogen). Plasma ctDNA vil bli ekstrahert ved bruk av QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit (Qiagen, Hilden, Tyskland). Genomisk DNA (gDNA) vil bli isolert fra perifert blod ved bruk av QIAamp DNA Blood Midi Kit (Qiagen, Tyskland) etter standardprotokoller.

      Bibliotekpreparering og sekvensering cfRNA-biblioteker vil bli generert ved bruk av Qiagen QIAseq cfRNA All-in-One Kit, optimalisert for lav RNA-input og korte fragmenter. Sekvensering vil bli utført på en NovaSeq X-sekvensator (Illumina, San Diego, CA, USA), som produserer 150 bp paired-end reads (2×150 bp) med en gjennomsnittlig dybde større enn 50 millioner reads for å maksimere deteksjonen av transkripter med lav forekomst.

      ctDNA og gDNA-bibliotekpreparering og sekvensering vil bli utført ved bruk av SureSelect V6 capture kit (Agilent, Santa Clara, CA, USA) og Illumina-teknologi (NovaSeq 6000, 150PE 2×150 bp), med en gjennomsnittlig sekvenseringsdybde på 18 Gb/prøve.

      Bioinformatisk analyse Kvaliteten på FASTQ-filer oppnådd fra sekvensering vil bli vurdert med FastQC (Quality Control Tool for High Throughput Sequence Data). Rå reads vil gjennomgå kvalitetskontroll med FastQC og MultiQC, etterfulgt av adaptertrimming og fjerning av lavkvalitets reads ved bruk av Trimmomatic. Aligning til det humane referansegenomet (GRCh38) vil bli utført med STAR (v2.7), og genoverflate kvantifisert ved bruk av featureCounts (Subread-pakken). Normalisering og differensiell ekspresjonsanalyse vil bli utført ved bruk av DESeq2 (Bioconductor), med justerte p-verdier <0,05 som signifikansgrense. Funksjonell og pathway-berikelsesanalyse vil bli utført med clusterProfiler, GOplot og GSEA. Differensielt uttrykte gener vil bli validert ved revers transkripsjon og kvantitativ real-time PCR.

      Genomisk analyse Paired-end reads vil bli alignet til det humane genomet (GRCh37) ved bruk av BWA-MEM (v0.7.17). De resulterende SAM-filene vil bli prosessert for å forbedre effektiviteten av nedstrømsanalyser, inkludert fjerning av duplikater ved bruk av MarkDuplicatesSpark (GATK). Grunnkvalitetsskår-rekalibrering vil bli utført med BaseRecalibrator og ApplyBQSR (GATK). Somatisk variantkalling vil bli utført med Mutect2 (GATK, paired mode), etterfulgt av filtrering ved bruk av FilterMutectCalls. Germline varianter (SNVs og INDELs) vil bli identifisert med HaplotypeCaller og filtrert ved bruk av harde filtre. Utvalgte varianter vil bli annotert med Funcotator, og variantpatogenisitet vurdert med Varank (v1.4.3). Frekvensen og fordelingen av detekterte SNVs og INDELs vil bli sammenlignet mot sunne donordatabaser (NHLBI-ESP og gnomAD) ved bruk av ANNOVAR.

      Multi-omisk integrasjon Omiske data vil bli integrert ved bruk av pipelines utviklet av Bioinformatikkenheten ved IBSAL. Maskinlæringsverktøy (Random Forest, SVM) og nettverksanalyse (Weighted Gene Co-expression Network Analysis, WGCNA) vil bli brukt for å identifisere felles og tumorspesifikke molekylære mønstre. Multi-Omics-Factor Analysis (MOFA). Integrasjonen av multi-omiske og kliniske data vil muliggjøre utvikling av prediktive modeller for respons på fysisk trening.

      Kliniske, funksjonelle og psykologiske vurderinger Alle kliniske og funksjonelle utfall vil bli samlet inn på tre tidspunkt: 1) før programmet starter, 2) etter 12 uker med intervensjon, 3) 6-måneders oppfølging. I alle tilfeller vil alle individer bli evaluert: Muskelstyrke (Dynamometri), kroppssammensetning (Tanita BC-418), funksjonell status (Short Physical Performance Battery), livskvalitet (EORTC QLQ-C30), Psykologisk velvære (Hospital anxiety and depression scale), søvnkvalitet (Athens Insomnia scale), fysisk aktivitetsnivå (International Physical Activity Questionnaire).

      Intervensjon Intervensjonen for begge grupper (styrketreningsprogram og hjemmebasert treningsprogram) er detaljert i de publiserte studioprotokollene.