Præcist fysisk træning til personlig onko-hematologi. (PEPOH)

Hovedformålet med PEPOH-projektet er at karakterisere og forudsige den kliniske respons på styrketræning hos patienter med solide og/eller hematologiske tumorer (under aktiv behandling og/eller under behandlingsforløbet) ved en udtømmende og systematisk integration af multi-omics-datasæt for at bestemme signaturer forbundet med behandlingstolerance, sygdomsprogression og overlevelse.

Flere specifikke mål udledes af dette hovedmål:

1. - Bestemme den immunmodulerende effekt af fysisk træning ved at dechifrere differentielle molekylære profiler i perifert blod ved næste generations sekventering (RNA, SNPs, CHIP), proteomik og metabolomik, som giver nye indsigter til en omfattende analyse af træningens effekt på patienter

2. - Evaluere effekten af et fysisk træningsprogram hos onkohematologiske patienter på multidimensionelle indikatorer for deres iboende kapacitet relateret til generel livskvalitet:

   1. - Funktionel fysisk tilstand (muskelstyrke, ganghastighed, balance og træthed).
   2. - Psykisk velvære og mental sundhed.
   3. - Kropskomposition og antropometriske variabler.

   4. - Søvnkvalitet, generel livskvalitet og kræftrelateret livskvalitet.

      Alle disse mål svarer til tre hovedprioriteter i nutidens onkologi:

      1. at forstå de fysiologiske og molekylære mekanismer, der ligger til grund for træningens terapeutiske effekter.
      2. at generere robuste beviser i højt sårbare og underrepræsenterede populationer, såsom patienter med hematologisk kræft.
      3. at etablere grundlaget for at inkorporere styrketræning som en standardiseret adjuvans intervention i den kliniske behandling af kræft.

      Den tilføjede værdi af PEPOH ligger i dens translationelle og tværfaglige tilgang, som kombinerer grundvidenskab med klinisk praksis, molekylærbiologi med motionsfysiologi og multi-omisk analyse med omfattende patientvurdering. Gennem denne ramme sigter projektet mod at bidrage til et paradigmskifte i onkologisk pleje ved at integrere fysisk træning som et personligt tilpasset terapeutisk værktøj i stand til at forbedre overlevelse, velvære og livskvalitet hos mennesker med kræft.

      Med tanke på PEPOH-projektets tværfaglige aspekt vil det molekylære fingeraftryk -opnået ved multi-omisk karakterisering- af onkohematologiske patienter under styrketræning være en aktiv for at levere den biologiske basis for dets terapeutiske brug, da det er relateret til behandlingstolerance og overlevelse. Yderligere kunne disse molekylære signaturer give nye biologiske indsigter i inflammationsregulering, energimetabolisme, tumorimmunitet, muskelplasticitet, aldring og skrøbelighed. Alle disse fund vil gøre det muligt for forskerne at dechifrere mekanismer, der forklarer den funktionelle og følelsesmæssige forbedring observeret efter træning.

      Desuden vil den dybdegående multi-omiske karakterisering af en velkarakteriseret og defineret patientkohorte levere nye datasæt, som kunne være meget nyttige til yderligere biomedicinske studier og en reference for det videnskabelige fællesskab.

      Fra et klinisk synspunkt vil den systematiske og præcise integration af molekylære og kliniske datasæt muliggøre udviklingen af prædiktive responsmodeller, som hjælper med at evaluere effektiviteten af træningsinterventioner for hver patient og tumor, kaldet præcisionstræning.

      Opsummerende vil PEPOH-projektet levere translationelle beviser til at støtte inkorporeringen af træning som en personligt tilpasset og omkostningseffektiv adjuvans intervention inden for den omfattende tilgang til patienter med kræft, hvilket bidrager til udviklingen af præcisionsonkologi.

      Studiedesign PEPOH er et randomiseret, kontrolleret klinisk forsøg. Studiet vil blive udført på Salamanca Universitetshospital med den tekniske og videnskabelige støtte fra FIBSAL.

      Population

      Forsøget vil inkludere fem patientkohorter svarende til følgende diagnoser: lungekræft, kolorektal kræft, brystkræft, kronisk lymfatisk leukæmi og multipelt myelom. Hver kohorte vil bestå af 50 patienter, hvilket resulterer i en total stikprøve på 250 patienter. Efter en baselinevurdering vil patienter blive tilfældigt tildelt (1:1) til en af to studiegrupper:

      Superviseret interventionsgruppe: et styrketræningsprogram udført to gange om ugen i 12 uger under professionel vejledning, suppleret med et hjemmebaseret træningsprogram.

      Kontrolgruppe: et hjemmebaseret træningsprogram, der følger de samme anbefalinger og retningslinjer som den superviserede gruppe, men uden superviserede personlige sessioner.

      Vurderinger vil blive udført ved baseline og efter den 12-ugers intervention med en yderligere opfølgning efter 6 måneder for at analysere vedvaren af kliniske og molekylære effekter på mellemlang sigt.

      Inklusionskriterier:

      • Voksne patienter (≥18 år), i stand til at underskrive informeret samtykke og villige til at deltage i studiet.
      • Performance status (ECOG) 0-2.

      Specifikke inklusionskriterier er defineret for hver kohorte involveret i studiet som følger:

      Lungekræft: Patienter diagnosticeret med ikke-småcellet lungecarcinom i metastatisk stadium, som er egnet til kombineret immunterapi og kemoterapi, med aktiv behandling.

      Kolorektal kræft: Patienter med stadium II, III eller IV resekeret kolorektal kræft, der gennemgår adjuvans kemoterapi.

      Brystkræft: Kvindelige patienter med histologisk bekræftet hormonreceptor-positiv/HER2-negativ brystkræft, der modtager aktiv hormonterapi (tamoxifen, aromatasehæmmer eller fulvestrant) i enten adjuvans eller stabil metastatisk fase.

      Kronisk lymfatisk leukæmi (CLL): Patienter diagnosticeret med CLL, der ikke har modtaget og ikke har behov for farmakologisk behandling.

      Multipelt myelom (MM): Patienter med en bekræftet ny diagnose af MM under aktiv første-linje behandling og ikke-kandidater til autolog transplantation.

      Eksklusionskriterier:

      Tilstedeværelse af ustabile knoglemetastaser eller omfattende knogleinvolvering forbundet med høj risiko for fraktur.

      Ukontrollerede kardiovaskulære, respiratoriske, muskuloskeletale eller metaboliske sygdomme, som kontraindicerer fysisk træning efter forskerens skøn.

      Eksplicit medicinsk kontraindikation mod træning. Dokumenteret dårlig overholdelse (<80%). Behandlingsafbrydelse, sygdomsprogression, intolerans eller enhver anden medicinsk, personlig eller logistisk omstændighed, som efter forskernes mening kan kompromittere deltagersikkerhed eller integriteten af studiet.

      Stikprøvestørrelse Et to-faktor ANOVA design med en mellem-individ faktor (kontrol- og interventionsgrupper) og en indenfor-individ faktor (for-efter og seks-måneders opfølgning) blev valgt til at evaluere studiet. Den totale nødvendige stikprøvestørrelse ville være 42, idet der tages højde for en effektstørrelse på f=0.20, et signifikansniveau på 5%, en styrke på 80% og en korrelation mellem gentagne målinger på 0.5. Det estimeres, at der kan være et tab til opfølgning på 20% mellem de to eksperimentelle grupper, og derfor er den totale stikprøvestørrelse 50 individer pr. kohorte.

      Metodologi Biologiske prøver fra studiet Perifere blodprøver (en 10 mL EDTA-rør) vil blive indsamlet ved tre tidspunkter: 1) før programmets start; 2) efter 12 ugers intervention; 3) 6-måneders opfølgning. Isolerede perifere mononukleære blodceller (PBMCs), serum og plasma, som vil blive korrekt opbevaret på IBSAL-biobanken under standardiserede forhold.

      Proteomisk Karakterisering Kvantitativ proteomisk analyse af plasma ved PreOmics® ENRICHplus teknologi, efterfulgt af væskekromatografi koblet til ionmobilitetsspektrometri (LC-IMS/MS), som vil muliggøre reproducerbar og højt følsom analyse fra et minimalt plasmavolumen (50µL). Kvantitativ proteomisk analyse af de eluerede peptider vil blive udført på et LC Evosep One system (Evosep Biosystems, Danmark), koblet til en MS timsTOF Pro 2 (Bruker Corporation, USA), ved brug af en separationsmetode på 60 prøver/dag. En DIA-PASEF tilgang vil blive anvendt med en masse/ladningsinterval fra 100 til 1700 og et ionmobilitetsinterval på 0.85-1.30 1/K0 med en cyklustid på 100ms.

      Immunfenotypering Til immunpopulationsanalyser (mål 1) vil forskerne bruge et panel inkluderende antistoffer mod CD45, CD3, CD4, CD8, CD5, CD7, TCR, CD27, CD45RA, CD127, CD25RA, CD56, HLA-DR, CD11c, CD123, CD33, CD14 og CD16 med en minimumsindhentning på 500.000 events. Dette panel vil muliggøre identifikation af forskellige subpopulationer af T-lymfocytter, NK-celler, dendritiske celler og monocytter. Til B-celleanalyse vil vi anvende LST-screeningsstrategien som beskrevet af EuroFlow. Alle analyser vil blive udført ved brug af en 8-farve FACScanto cytometer og Infinicyt software. Alle prøver vil blive behandlet på University of Salamancas Generelle Flowcytometri Service (www.nucleus.usal.es) og på Hematologiafdelingen.

      Metabolomisk Profilering Plasmaproteiner vil blive præcipiteret med methanol, og glycerofosfolipider ekstraheret ved SPE. Efter filtrering vil hver opløsning blive justeret til 600 µL med D₂O og overført til 5 mm NMR-rør. NMR-analyser vil blive udført ved 298 K på en Bruker Avance Neo 400 MHz spektrometer med en kryoprobe. Parametre vil blive optimeret til metabolitkvantificering ved brug af Chenomx NMR Suite 10 (Chenomx, Edmonton, Canada). Metabolitidentifikation og -kvantificering vil blive udført med denne software, som muliggør pålidelig dekonvolution og koncentrationsbestemmelse i komplekse spektre. Protonpeak-tildelinger vil yderligere blive valideret ved at sammenligne kemiske skift med Human Metabolome Database (http://www.hmdb.ca).

      Transkriptomisk og Genomisk Analyse cfRNA og DNA Ekstraktion Plasma cfRNA-ekstraktion vil blive udført ved brug af miRNeasy Serum/Plasma Advanced Kit (Qiagen), optimeret til lavt udbytte og korte RNA-fragmenter. RNA-koncentration og renhed vil blive bestemt fluorometrisk ved brug af Qubit RNA HS Assay (Invitrogen). Plasma ctDNA vil blive ekstraheret ved brug af QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit (Qiagen, Hilden, Tyskland). Genomisk DNA (gDNA) vil blive isoleret fra perifert blod ved brug af QIAamp DNA Blood Midi Kit (Qiagen, Tyskland) efter standardprotokoller.

      Biblioteksforberedelse og Sekventering cfRNA-biblioteker vil blive genereret ved brug af Qiagen QIAseq cfRNA All-in-One Kit, optimeret til lav RNA-input og korte fragmenter. Sekventering vil blive udført på en NovaSeq X sekventer (Illumina, San Diego, CA, USA), der producerer 150bp paired-end reads (2×150bp) med en gennemsnitsdybde større end 50 millioner reads for at maksimere detektionen af lav-forekomst transkripter. ctDNA og gDNA biblioteksforberedelse og sekventering vil blive udført ved brug af SureSelect V6 capture kit (Agilent, Santa Clara, CA, USA) og Illumina teknologi (NovaSeq 6000, 150PE 2×150bp), der når en gennemsnitlig sekventeringsdybde på 18Gb/prøve.

      Bioinformatisk Analyse Kvaliteten af FASTQ-filer opnået fra sekventering vil blive vurderet med FastQC (Quality Control Tool for High Throughput Sequence Data). Rå reads vil gennemgå kvalitetskontrol med FastQC og MultiQC, efterfulgt af adaptertrimning og fjernelse af lavkvalitets reads ved brug af Trimmomatic. Aligning til det humane referencegenom (GRCh38) vil blive udført med STAR (v2.7), og genoverflod kvantificeret ved brug af featureCounts (Subread-pakke). Normalisering og differentiel ekspressionsanalyse vil blive udført ved brug af DESeq2 (Bioconductor), med anvendelse af justerede p-værdier <0.05 som signifikansgrænse. Funktionelle og stive berigelsesanalyser vil blive udført med clusterProfiler, GOplot og GSEA. Differentielt udtrykte gener vil blive valideret ved revers transkription og kvantitativ realtids PCR.

      Genomisk Analyse Paired-end reads vil blive alignet til det humane genom (GRCh37) ved brug af BWA-MEM (v0.7.17). De resulterende SAM-filer vil blive behandlet for at forbedre effektiviteten af efterfølgende analyser, inklusive fjernelse af duplikater ved brug af MarkDuplicatesSpark (GATK). Basekvalitetsscore-rekalibrering vil blive udført med BaseRecalibrator og ApplyBQSR (GATK). Somatisk variantkald vil blive udført med Mutect2 (GATK, paired mode), efterfulgt af filtrering ved brug af FilterMutectCalls. Germline varianter (SNVs og INDELs) vil blive identificeret med HaplotypeCaller og filtreret ved brug af hårde filtre. Udvalgte varianter vil blive annoteret med Funcotator, og variantpatogenicitet vurderet med Varank (v1.4.3). Hyppigheden og fordelingen af detekterede SNVs og INDELs vil blive sammenlignet med sunde donor-databaser (NHLBI-ESP og gnomAD) ved brug af ANNOVAR.

      Multi-Omics Integration Omics-data vil blive integreret ved brug af pipelines udviklet af IBSALs Bioinformatik Enhed. Maskinlæringsværktøjer (Random Forest, SVM) og netværksanalyse (Weighted Gene Co-expression Network Analysis, WGCNA) vil blive anvendt til at identificere fælles og tumor-type-specifikke molekylære mønstre. Multi-OMics-Factor Analysis (MOFA). Integrationen af multi-omiske og kliniske data vil muliggøre udviklingen af prædiktive modeller for respons på fysisk træning.

      Kliniske, Funktionelle og Psykologische Vurderinger Alle kliniske og funktionelle resultater vil blive indsamlet ved tre tidspunkter: 1) før programmets start, 2) efter 12 ugers intervention, 3) 6-måneders opfølgning.

      I alle tilfælde vil alle individer blive evalueret: Muskelstyrke (Dynamometri), kropskomposition (Tanita BC-418), funktionel status (Short Physical Performance Battery), livskvalitet (EORTC QLQ-C30), Psykisk velvære (Hospital anxiety and depression scale), søvnkvalitet (Athens Insomnia scale), fysisk aktivitetsniveau (International Physical Activity Questionnaire).

      Intervention Interventionen for begge grupper (styrketræningsprogram og et hjemmebaseret træningsprogram) er detaljeret i de offentliggjorte studieprotokoller.