Precíz Testmozgás a Személyre Szabott Onko-Hematológiában. (PEPOH)

A PEPOH projekt fő célja, hogy a szilárd és/vagy hematológiai daganatokban szenvedő betegek (aktív terápia alatt és/vagy a terápia folyamata során) erősítő edzésre adott klinikai válaszreakció jellemzésével és előrejelzésével, a multi-omics adatkészletek átfogó és szisztematikus integrálásával, a kezeléstűréshez, a betegségprogresszióhoz és a teljes túléléshez kapcsolódó aláírások meghatározásával foglalkozik.

Számos konkrét célkitűzés származik ebből a fő célból:

1. - A fizikai gyakorlat immunmodulátor hatásának meghatározása a perifériás vérben található differenciális molekuláris profilok dekódolásával a következő generációs szekvenálás (RNA, SNP-ek, CHIP), proteomika és metabolomika segítségével, amelyek új betekintést nyújtanak a gyakorlat betegekre gyakorolt hatásának átfogó elemzéséhez.

2. - Fizikai gyakorlat program hatásának értékelése onkohematológiai betegeknél az ő belső kapacitásukkal összefüggő multidimenzionális mutatókra, amelyek a teljes életminőségükhöz kapcsolódnak:

   1. - Funkcionális fizikai állapot (izomerő, járási sebesség, egyensúly és fáradtság).
   2. - Pszichés jólét és mentális egészség.
   3. - Testösszetétel és antropometriai változók.

   4. - Alvásminőség, teljes életminőség és a daganattal összefüggő életminőség.

      Mindezek a célkitűzések a jelenlegi onkológia három fő prioritására válaszolnak:

      1. a gyakorlat terápiás hatásait mögött meghúzódó fiziológiai és molekuláris mechanizmusok megértése.
      2. robusztus bizonyítékok generálása erősen sérülékeny és alulreprezentált populációkban, mint például hematológiai daganatos betegek.
      3. az erősítő edzés szabványosított adjuváns beavatkozásként történő beépítésének alapjainak megteremtése a daganatok klinikai kezelésébe.

      A PEPOH hozzáadott értéke a transzlációs és multidiszciplináris megközelítésében rejlik, amely kombinálja az alapvető tudományt a klinikai gyakorlattal, a molekuláris biológiát a gyakorlatfiziológiával, valamint a multi-omics elemzést az átfogó betegértékeléssel. Ezen keretrendszeren keresztül a projekt célja, hogy hozzájáruljon a paradigmaváltáshoz az onkológiai ellátásban a fizikai gyakorlat személyre szabott terápiás eszközként történő integrálásával, amely képes javítani a túlélést, a jólétet és az életminőséget a daganatos betegeknél.

      A PEPOH projekt multidiszciplináris aspektusát figyelembe véve az erősítő edzés alatt álló onkohematológiai betegek molekuláris ujjlenyomata -a multi-omics jellemzés által nyert- érték lesz annak biológiai alapjainak biztosításához a terápiás alkalmazásában, mivel az kapcsolódik a kezeléstűréshez és a túléléshez. Emellett ezek a molekuláris aláírások új biológiai betekintéseket nyújthatnak a gyulladás szabályozásába, az energiaanyagcserebe, a daganat immunitásba, az izom plaszticitásába, az öregedésbe és a törékenységbe. Mindezek a megállapítások lehetővé teszik a kutatók számára, hogy dekódolják azokat a mechanizmusokat, amelyek megmagyarázzák a gyakorlat után megfigyelt funkcionális és érzelmi javulást.

      Sőt, a jól jellemzett és meghatározott betegkohorsz mély multi-omics jellemzése új adatkészleteket fog biztosítani, amelyek rendkívül hasznosak lehetnek további biomedicinális tanulmányokhoz és referenciaként szolgálhatnak a tudományos közösség számára.

      Klinikai szempontból a molekuláris és klinikai adatkészletek szisztematikus és pontos integrálása lehetővé teszi a prediktív válaszmodellek fejlesztését, amelyek segítenek értékelni a gyakorlati beavatkozások hatékonyságát minden egyes betegnél és daganatnál, az úgynevezett precíziós gyakorlat.

      Összefoglalva, a PEPOH projekt transzlációs bizonyítékokat fog szolgáltatni a gyakorlat személyre szabott és költséghatékony adjuváns beavatkozásként történő beépítésének támogatásához a daganatos betegek átfogó megközelítésében, hozzájárulva a precíziós onkológia fejlesztéséhez.

      Tanulmánytervezés A PEPOH egy randomizált, kontrollált klinikai vizsgálat. A vizsgálat a Salamancai Egyetemi Kórházban fog zajlani, a FIBSAL technikai és tudományos támogatásával.

      Populáció

      A vizsgálat öt betegkohorszát fogja magába foglalni, amelyek a következő diagnózisoknak felelnek meg: tüdőrák, vastagbél- és végbélrák, emlőrák, krónikus limfocitás leukémia és multiplex myeloma. Minden kohorsz 50 betegből fog állni, így a teljes minta 250 beteg lesz. Az alapvonal-értékelés után a betegeket véletlenszerűen (1:1) osztják be a két vizsgálati csoport egyikébe:

      Felügyelt intervenciós csoport: egy erősítő edzésprogram, amely hetente kétszer 12 hétig zajlik szakmai felügyelet mellett, kiegészítve egy otthoni gyakorlatprogrammal.

      Kontrollcsoport: egy otthoni gyakorlatprogram, amely ugyanazokat a javaslatokat és irányelveket követi, mint a felügyelt csoport, de felügyelt személyes ülések nélkül.

      Az értékelések az alapvonalon és a 12 hetes intervenció után kerülnek végrehajtásra, további követéssel 6 hónap múlva, hogy elemezzék a klinikai és molekuláris hatások középtávú perzisztenciáját.

      Bevételi kritériumok:

      • Felnőtt betegek (≥18 év), akik képesek aláírni a tájékoztatott beleegyezést és hajlandók részt venni a vizsgálatban.
      • Teljesítményállapot (ECOG) 0-2.

      Konkrét bevételi kritériumok vannak meghatározva a vizsgálatban részt vevő minden kohorsz számára a következőképpen:

      Tüdőrák: Nem kissejtes tüdőrákban szenvedő betegek metastatikus stádiumban, alkalmasak kombinált immunterápiára és kemoterápiára, aktív kezeléssel.

      Vastagbél- és végbélrák: II., III. vagy IV. stádiumú, reszekált vastagbél- és végbélrákban szenvedő betegek, akik adjuváns kemoterápián mennek keresztül.

      Emlőrák: Női betegek hisztológiailag megerősített hormonreceptor-pozitív/HER2-negatív emlőrákkal, akik aktív hormonterápiát kapnak (tamoxifen, aromatáz gátló vagy fulvestrant) akár adjuváns, akár stabilis metastatikus fázisban.

      Krónikus limfocitás leukémia (CLL): CLL-ben diagnosztizált betegek, akik nem kaptak és nincs szükségük gyógyszeres kezelésre.

      Multiplex myeloma (MM): Új MM diagnózissal megerősített betegek aktív első vonalbeli kezelés alatt és nem jelöltek autológ transzplantációra.

      Kizárási kritériumok:

      Instabil csontáttétek vagy kiterjedt csontérintettség jelenléte, amely magas töréskockázattal jár.

      Kontrollálatlan kardiovaszkuláris, légzőszervi, mozgásszervi vagy anyagcsere-betegségek, amelyek a kutató megítélése szerint ellenjavallják a fizikai gyakorlatot.

      Explicit orvosi ellenjavallat az edzéshez. Dokumentált rossz betartás (<80%). Kezelés megszakítása, betegségprogresszió, intolerancia vagy bármely más orvosi, személyes vagy logisztikai körülmény, amely a kutatók véleménye szerint veszélyeztetheti a résztvevők biztonságát vagy a vizsgálat integritását.

      Mintanagyság A vizsgálat mintanagyságának értékelésére egy kétfaktoros ANOVA tervezetet választottak egy egyéni faktor között (kontroll és intervenciós csoportok) és egy egyéni faktor belül (előzetes-utólagos és hat hónapos követés). A szükséges teljes mintanagyság 42 lenne, figyelembe véve egy f=0,20 hatásnagyságot, 5%-os szignifikancia szintet, 80%-os erőt és 0,5-ös korrelációt az ismételt mérések között. Becslés szerint 20%-os veszteség lehet a két kísérleti csoport között, ezért a teljes mintanagyság kohorszonként 50 egyén.

      Metodológia A vizsgálat biológiai mintái Perifériás vér mintákat (egy 10 ml-es EDTA cső) három időpontban gyűjtenek: 1) a program megkezdése előtt; 2) a 12 hetes intervenció után; 3) 6 hónapos követés. Izolált perifériás vér mononukleáris sejtek (PBMC-k), szérum és plazma, amelyek megfelelően megőrződnek az IBSAL biobankban szabványosított körülmények között.

      Proteomikai Jellemzés Kvantitatív proteomikai elemzés plazmából PreOmics® ENRICHplus technológiával, majd folyadékkromatográfiával kombinálva ionmobilitás spektrometriával (LC-IMS/MS), amely lehetővé teszi reprodukálható és nagyon érzékeny elemzést minimális plazma térfogatból (50µL).

      A kioldott peptidek kvantitatív proteomikai elemzését egy LC Evosep One rendszeren (Evosep Biosystems, Dánia) fogják végrehajtani, amely egy MS timsTOF Pro 2-hez (Bruker Corporation, USA) kapcsolódik, 60 minta/nap szeparációs módszerrel. Egy DIA-PASEF megközelítést alkalmaznak 100 és 1700 közötti tömeg/töltés tartománnyal és 0,85-1,30 1/K0 ionmobilitás tartománnyal, 100ms ciklusidővel.

      Immunofenotipizálás Immunpopuláció elemzésekhez (1. célkitűzés) a kutatók egy panelt fognak használni, amely tartalmazza a CD45, CD3, CD4, CD8, CD5, CD7, TCR, CD27, CD45RA, CD127, CD25RA, CD56, HLA-DR, CD11c, CD123, CD33, CD14 és CD16 elleni antitesteket legalább 500 000 esemény beszerzésével. Ez a panel lehetővé teszi a T limfociták, NK sejtek, dendritikus sejtek és monociták különböző szubpopulációinak azonosítását. B sejt elemzéshez az EuroFlow által leírt LST szűrési stratégiát fogjuk alkalmazni. Minden elemzést egy 8 színű FACScanto citométerrel és Infinicyt szoftverrel fognak végrehajtani. Minden mintát a Salamancai Egyetem Általános Folyadékcito-metriai Szolgáltatásánál (www.nucleus.usal.es) és a Hematológiai Osztályon dolgoznak fel.

      Metabolomikai Profilozás A plazma fehérjéket metanollal csapják ki, és a glicerofoszfolipideket SPE-vel extrahálják. Szűrés után minden oldatot 600 µL-re állítanak be D₂O-val és 5 mm-es NMR csövekbe transzferálják. Az NMR elemzéseket 298 K-on egy Bruker Avance Neo 400 MHz spektrométeren cryoprobe-dal fognak végrehajtani. A paramétereket optimalizálják a metabolitok kvantifikálásához a Chenomx NMR Suite 10 (Chenomx, Edmonton, Kanada) használatával. A metabolitok azonosítása és kvantifikálása ezzel a szoftverrel történik, amely megbízható dekonvolúciót és koncentráció meghatározást tesz lehetővé komplex spektrumokban. A proton csúcsok hozzárendelését tovább érvényesítik a kémiai eltolódások összehasonlításával a Human Metabolome Database-val (http://www.hmdb.ca).

      Transzkriptomikai és Genomikai Analízis cfRNA és DNS Kivonatolás A plazma cfRNA kivonatolását a miRNeasy Serum/Plasma Advanced Kit (Qiagen) segítségével fogják elvégezni, amely alacsony hozamú és rövid RNS fragmentumokra optimalizált. Az RNS koncentrációt és tisztaságát fluorometrikusan határozzák meg a Qubit RNA HS Assay (Invitrogen) segítségével. A plazma ctDNS-t a QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit (Qiagen, Hilden, Németország) segítségével fogják kivonatolni. A genomikus DNS (gDNS) perifériás vérből izolálódik a QIAamp DNS Blood Midi Kit (Qiagen, Németország) segítségével szabványos protokollok szerint.

      Könyvtár Előkészítés és Szekvenálás A cfRNA könyvtárakat a Qiagen QIAseq cfRNA All-in-One Kit segítségével fogják generálni, amely alacsony RNS bemenetre és rövid fragmentumokra optimalizált. A szekvenálást egy NovaSeq X szekvenálón (Illumina, San Diego, CA, USA) fogják végrehajtani, 150 bp párosított végekkel (2×150bp), átlagosan több mint 50 millió olvasattal, hogy maximalizálják az alacsony abundanciájú transzkriptok detektálását.

      A ctDNS és gDNS könyvtár előkészítés és szekvenálás a SureSelect V6 capture kit (Agilent, Santa Clara, CA, USA) és Illumina technológia (NovaSeq 6000, 150PE 2×150bp) segítségével fog zajlani, elérve átlagosan 18Gb/minta szekvenálási mélységet.

      Bioinformatikai Analízis A szekvenálásból nyert FASTQ fájlok minőségét a FastQC (Quality Control Tool for High Throughput Sequence Data) segítségével értékelik. A nyers olvasatok minőségellenőrzésen mennek keresztül a FastQC és MultiQC segítségével, majd adapter csonkolás és alacsony minőségű olvasatok eltávolítása a Trimmomatic segítségével. Az igazítás az emberi referencia genomhoz (GRCh38) a STAR (v2.7) segítségével történik, és a gén abundanciát a featureCounts (Subread csomag) segítségével kvantifikálják. A normalizálás és differenciális expresszió analízis a DESeq2 (Bioconductor) segítségével történik, alkalmazva korrigált p-értékeket <0,05-öt szignifikancia küszöbként. Funkcionális és útvonal gazdagodási elemzéseket a clusterProfiler, GOplot és GSEA segítségével fognak végezni. A differenciálisan expresszált géneket reverz transzkripcióval és kvantitatív valós idejű PCR-rel fogják validálni.

      Genomikai Analízis A párosított végekkel rendelkező olvasatok az emberi genomhoz (GRCh37) igazodnak a BWA-MEM (v0.7.17) segítségével. Az eredményül kapott SAM fájlokat feldolgozzák a lefelé irányuló elemzések hatékonyságának javításához, beleértve a duplikátumok eltávolítását a MarkDuplicatesSpark (GATK) segítségével. A bázis minőségpont újrakalibrálást a BaseRecalibrator és ApplyBQSR (GATK) segítségével fogják végrehajtani. A szomatikus variáns hívás a Mutect2 (GATK, páros mód) segítségével történik, majd szűrés a FilterMutectCalls segítségével. A germline variánsokat (SNV-k és INDEL-ek) a HaplotypeCaller segítségével azonosítják és hard filterekkel szűrik. A kiválasztott variánsokat a Funcotator segítségével annotálják, és a variáns patogenicitását a Varank (v1.4.3) segítségével értékelik. Az észlelt SNV-k és INDEL-ek gyakoriságát és eloszlását egészséges donor adatbázisokkal (NHLBI-ESP és gnomAD) hasonlítják össze az ANNOVAR segítségével.

      Multi-Omics Integráció Az omics adatokat az IBSAL Bioinformatikai Egysége által fejlesztett folyamatok segítségével fogják integrálni. Gépi tanulási eszközöket (Random Forest, SVM) és hálózatelemzést (Weighted Gene Co-expression Network Analysis, WGCNA) alkalmaznak a közös és daganattípus-specifikus molekuláris minták azonosításához. Multi-OMics-Factor Analysis (MOFA). A multi-omics és klinikai adatok integrálása lehetővé teszi a fizikai gyakorlatra adott válasz prediktív modelljeinek fejlesztését.

      Klinikai, Funkcionális és Pszichológiai Értékelések Minden klinikai és funkcionális eredményt három időpontban gyűjtenek: 1) a program megkezdése előtt, 2) a 12 hetes intervenció után, 3) 6 hónapos követés.

      Minden esetben minden egyént értékelnek: Izomerő (Dinamometria), testösszetétel (Tanita BC-418), funkcionális állapot (Short Physical Performance Battery), életminőség (EORTC QLQ-C30), Pszichés jólét (Kórházi szorongás és depresszió skála), alvásminőség (Athens Insomnia skála), fizikai aktivitás szintje (International Physical Activity Questionnaire).

      Intervenció Mindkét csoport intervenciója (erősítő edzésprogram és otthoni gyakorlatprogram) részletesen le van írva a publikált vizsgálati protokollokban.