个性化肿瘤血液学精准体能训练。 (PEPOH)

PEPOH项目的主要目标是通过对多组学数据集进行全面系统整合，以确定与治疗耐受性、疾病进展和总生存期相关的特征，从而表征和预测实体瘤和/或血液肿瘤患者（正在接受积极治疗和/或在治疗过程中）对力量训练的临床反应。

从这一主要目标衍生出几个具体目标：

1. - 通过新一代测序（RNA、SNPs、CHIP）、蛋白质组学和代谢组学解析外周血中的差异分子谱，确定体育锻炼的免疫调节作用，为全面分析运动对患者的影响提供新见解

2. - 评估体育锻炼计划对血液肿瘤患者内在能力多维指标的影响，这些指标与总体生活质量相关：

   1. - 功能性身体状况（肌肉力量、步行速度、平衡能力和疲劳度）。
   2. - 心理健康与精神状态。
   3. - 身体成分和人体测量变量。

   4. - 睡眠质量、总体生活质量和癌症相关生活质量。

      所有这些目标回应了当前肿瘤学的三个主要优先事项：

      1. 理解运动治疗效果的生理和分子机制。
      2. 在高度脆弱和代表性不足的人群（如血液癌症患者）中生成有力证据。
      3. 为将力量训练作为标准化辅助干预措施纳入癌症临床管理奠定基础。

      PEPOH项目的附加价值在于其转化性和多学科方法，将基础科学与临床实践、分子生物学与运动生理学、多组学分析与全面患者评估相结合。 通过这一框架，该项目旨在通过将体育锻炼整合为一种能够改善癌症患者生存率、幸福感和生活质量的个性化治疗工具，推动肿瘤护理模式的转变。

      考虑到PEPOH项目的多学科性质，通过多组学表征获得的力量训练下血液肿瘤患者的分子指纹将作为资产，为其治疗应用的生物学基础提供支持，因为它与治疗耐受性和生存期相关。 此外，这些分子特征可能为炎症调节、能量代谢、肿瘤免疫、肌肉可塑性、衰老和衰弱提供新的生物学见解。 所有这些发现将使研究人员能够解释运动后观察到的功能和情绪改善的机制。

      此外，对特征明确且定义清晰的患者队列进行深度多组学表征将提供新的数据集，这些数据集可能对进一步的生物医学研究非常有用，并成为科学界的参考。

      从临床角度来看，分子和临床数据集的系统准确整合将有助于开发预测反应模型，以评估运动干预对每位患者和肿瘤的疗效，称为精准运动。

      总之，PEPOH项目将提供转化证据，支持将运动作为一种个性化且具有成本效益的辅助干预措施纳入癌症患者的综合治疗方法中，为精准肿瘤学的发展做出贡献。

      研究设计 PEPOH是一项随机对照临床试验。 该研究将在萨拉曼卡大学医院进行，并得到FIBSAL的技术和科学支持。

      人群

      试验将包括五个患者队列，对应以下诊断：肺癌、结直肠癌、乳腺癌、慢性淋巴细胞白血病和多发性骨髓瘤。 每个队列将由50名患者组成，总样本量为250名患者。 基线评估后，患者将按1:1随机分配到两个研究组之一：

      监督干预组：在专业监督下进行的力量训练计划，每周两次，持续12周，辅以家庭锻炼计划。

      对照组：遵循与监督组相同的建议和指南的家庭锻炼计划，但没有监督的面对面课程。

      评估将在基线和12周干预后进行，并在6个月时进行额外随访，以分析中期临床和分子效应的持续性。

      纳入标准：

      • 成年患者（≥18岁），能够签署知情同意书并愿意参与研究。
      • 体能状态（ECOG）0-2。

      研究涉及的每个队列的具体纳入标准定义如下：

      肺癌：诊断为转移期非小细胞肺癌的患者，符合联合免疫治疗和化疗条件，正在接受积极治疗。

      结直肠癌：接受辅助化疗的II、III或IV期结直肠癌切除患者。

      乳腺癌：组织学确认的激素受体阳性/HER2阴性乳腺癌女性患者，正在接受积极激素治疗（他莫昔芬、芳香化酶抑制剂或氟维司群），处于辅助或稳定转移阶段。

      慢性淋巴细胞白血病（CLL）：诊断为CLL且未接受且不需要药物治疗的患者。

      多发性骨髓瘤（MM）：确诊新诊断MM并正在接受一线积极治疗且不适合自体移植的患者。

      排除标准：

      存在不稳定的骨转移或广泛骨受累，伴有高骨折风险。

      未受控制的心血管、呼吸系统、肌肉骨骼或代谢疾病，研究者认为禁忌体育锻炼。

      明确的医学禁忌症禁止运动训练。 记录在案的依从性差（<80%）。 治疗中断、疾病进展、不耐受或任何其他医学、个人或后勤情况，研究者认为可能危及参与者安全或研究完整性。

      样本量 选择双因素方差分析设计，包含个体间因素（对照组和干预组）和个体内因素（干预前后和六个月随访），以评估研究的样本量。 考虑到效应大小f=0.20、显著性水平5%、功效80%以及重复测量间相关性0.5，所需总样本量为42。 估计两个实验组之间可能有20%的失访，因此每个队列的总样本量为50人。

      方法 研究生物样本 将在三个时间点采集外周血样本（一个10 mL EDTA管）：1）计划开始前；2）干预12周后；3）6个月随访。 分离的外周血单个核细胞（PBMCs）、血清和血浆将在IBSAL生物库中按标准化条件妥善保存。

      蛋白质组学表征 通过PreOmics® ENRICHplus技术对血浆进行定量蛋白质组学分析，然后进行液相色谱-离子迁移谱联用（LC-IMS/MS），这将允许从最小血浆体积（50µL）进行可重复且高灵敏度的分析。

      将在LC Evosep One系统（Evosep Biosystems，丹麦）上进行洗脱肽段的定量蛋白质组学分析，该系统与MS timsTOF Pro 2（Bruker Corporation，美国）耦合，使用60个样品/天的分离方法。 将应用DIA-PASEF方法，质荷比范围为100至1700，离子迁移范围为0.85-1.30 1/K0，循环时间为100ms。

      免疫表型分析 对于免疫群体分析（目标1），研究人员将使用一个包含针对CD45、CD3、CD4、CD8、CD5、CD7、TCR、CD27、CD45RA、CD127、CD25RA、CD56、HLA-DR、CD11c、CD123、CD33、CD14和CD16抗体的面板，最小采集事件数为500,000。 该面板将允许识别T淋巴细胞、NK细胞、树突状细胞和单核细胞的不同亚群。 对于B细胞分析，我们将采用EuroFlow描述的LST筛选策略。 所有分析将使用8色FACScanto流式细胞仪和Infinicyt软件进行。 所有样本将在萨拉曼卡大学通用流式细胞术服务部（www.nucleus.usal.es）和血液科处理。

      代谢组学分析 血浆蛋白将用甲醇沉淀，甘油磷脂通过固相萃取（SPE）提取。 过滤后，每种溶液将用D₂O调整至600 µL并转移到5 mm NMR管中。 NMR分析将在298 K下在配备低温探头的Bruker Avance Neo 400 MHz光谱仪上进行。 将使用Chenomx NMR Suite 10（Chenomx，埃德蒙顿，加拿大）优化代谢物定量参数。 代谢物鉴定和定量将使用该软件进行，该软件能够在复杂光谱中进行可靠的去卷积和浓度测定。 质子峰分配将通过将化学位移与人类代谢组数据库（http://www.hmdb.ca）进行比较进一步验证。

      转录组和基因组分析 cfRNA和DNA提取 血浆cfRNA提取将使用miRNeasy Serum/Plasma Advanced Kit（Qiagen）进行，该试剂盒针对低产量和短RNA片段进行了优化。 RNA浓度和纯度将使用Qubit RNA HS Assay（Invitrogen）荧光法测定。血浆ctDNA将使用QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit（Qiagen，希尔登，德国）提取。 基因组DNA（gDNA）将使用QIAamp DNA Blood Midi Kit（Qiagen，德国）按照标准方案从外周血中分离。

      文库制备和测序 cfRNA文库将使用Qiagen QIAseq cfRNA All-in-One Kit生成，该试剂盒针对低RNA输入和短片段进行了优化。 测序将在NovaSeq X测序仪（Illumina，圣地亚哥，加利福尼亚州，美国）上进行，产生150bp双端读长（2×150bp），平均深度大于5000万读长，以最大化低丰度转录本的检测。

      ctDNA和gDNA文库制备和测序将使用SureSelect V6捕获试剂盒（Agilent，圣克拉拉，加利福尼亚州，美国）和Illumina技术（NovaSeq 6000，150PE 2×150bp）进行，达到平均测序深度18Gb/样本。

      生物信息学分析 从测序获得的FASTQ文件质量将使用FastQC（高通量序列数据质量控制工具）评估。 原始读长将使用FastQC和MultiQC进行质量控制，然后使用Trimmomatic进行接头修剪和低质量读长去除。 与人参考基因组（GRCh38）的比对将使用STAR（v2.7）进行，基因丰度使用featureCounts（Subread包）量化。 归一化和差异表达分析将使用DESeq2（Bioconductor）进行，应用调整后p值<0.05作为显著性阈值。 功能和通路富集分析将使用clusterProfiler、GOplot和GSEA进行。 差异表达基因将通过逆转录和实时定量PCR验证。

      基因组分析 双端读长将使用BWA-MEM（v0.7.17）与人基因组（GRCh37）比对。 生成的SAM文件将被处理以提高下游分析效率，包括使用MarkDuplicatesSpark（GATK）去除重复。 碱基质量分数重新校准将使用BaseRecalibrator和ApplyBQSR（GATK）进行。 体细胞变异调用将使用Mutect2（GATK，配对模式）进行，然后使用FilterMutectCalls过滤。 种系变异（SNV和INDEL）将使用HaplotypeCaller识别，并使用硬过滤器过滤。 选定的变异将使用Funcotator注释，变异致病性使用Varank（v1.4.3）评估。 检测到的SNV和INDEL的频率和分布将使用ANNOVAR与健康供体数据库（NHLBI-ESP和gnomAD）进行比较。

      多组学整合 组学数据将使用IBSAL生物信息学单元开发的流程进行整合。 将应用机器学习工具（随机森林、支持向量机）和网络分析（加权基因共表达网络分析，WGCNA）来识别常见和肿瘤类型特异性分子模式。 多组学因子分析（MOFA）。 多组学和临床数据的整合将有助于开发体育锻炼反应的预测模型。

      临床、功能和心理评估 所有临床和功能结果将在三个时间点收集：1）计划开始前，2）干预12周后，3）6个月随访。

      在所有情况下，所有个体都将接受评估：肌肉力量（测力计）、身体成分（Tanita BC-418）、功能状态（简短体能表现电池）、生活质量（EORTC QLQ-C30）、心理健康（医院焦虑抑郁量表）、睡眠质量（雅典失眠量表）、身体活动水平（国际身体活动问卷）。

      干预 两组（力量训练计划和家庭锻炼计划）的干预细节在已发表的研究方案中详细说明。