Precyzyjne Ćwiczenia Fizyczne dla Spersonalizowanej Onko-Hematologii. (PEPOH)

Głównym celem projektu PEPOH jest scharakteryzowanie i przewidzenie odpowiedzi klinicznej na trening siłowy w guzach litych i/lub hematologicznych u pacjentów (podczas aktywnej terapii i/lub w trakcie procesu terapeutycznego) poprzez wyczerpującą i systematyczną integrację zestawów danych multi-omowych w celu określenia sygnatur związanych z tolerancją leczenia, progresją choroby i całkowitym przeżyciem.

Z tego głównego celu wynika kilka konkretnych celów:

1. - Określenie immunomodulacyjnego efektu aktywności fizycznej poprzez rozszyfrowanie różnicowych profili molekularnych we krwi obwodowej za pomocą sekwencjonowania nowej generacji (RNA, SNP, CHIP), proteomiki i metabolomiki, co dostarcza nowych spostrzeżeń do kompleksowej analizy wpływu ćwiczeń na pacjentów.

2. - Ocenę wpływu programu aktywności fizycznej u pacjentów onkohematologicznych na wielowymiarowe wskaźniki ich wewnętrznej zdolności związane z ogólną jakością życia:

   1. - Stan funkcjonalny fizyczny (siła mięśni, prędkość chodu, równowaga i zmęczenie).
   2. - Dobrostan psychiczny i zdrowie psychiczne.
   3. - Skład ciała i zmienne antropometryczne.

   4. - Jakość snu, ogólną jakość życia i jakość życia związaną z nowotworem.

      Wszystkie te cele odpowiadają trzem głównym priorytetom w obecnej onkologii:

      1. Zrozumienie fizjologicznych i molekularnych mechanizmów leżących u podstaw terapeutycznych efektów ćwiczeń.
      2. Generowanie solidnych dowodów wśród wysoce wrażliwych i niedoreprezentowanych populacji, takich jak pacjenci z nowotworami hematologicznymi.
      3. Ustanowienie podstaw do włączenia treningu siłowego jako ustandaryzowanej interwencji adiuwantowej w ramach klinicznego postępowania w nowotworach.

      Dodatkowa wartość PEPOH leży w jego translacyjnym i multidyscyplinarnym podejściu, które łączy naukę podstawową z praktyką kliniczną, biologię molekularną z fizjologią ćwiczeń oraz analizę multi-omiczną z kompleksową oceną pacjenta. Poprzez tę strukturę projekt ma na celu przyczynienie się do zmiany paradygmatu w opiece onkologicznej poprzez integrację aktywności fizycznej jako spersonalizowanego narzędzia terapeutycznego zdolnego poprawić przeżycie, dobrostan i jakość życia u osób z nowotworem.

      Mając na uwadze multidyscyplinarny aspekt projektu PEPOH, molekularny odcisk palca – uzyskany poprzez charakterystykę multi-omiczną – u pacjentów onkohematologicznych poddanych treningowi siłowemu będzie atutem w dostarczeniu biologicznych podstaw jego terapeutycznego zastosowania, ponieważ jest on związany z tolerancją leczenia i przeżyciem. Dodatkowo, te sygnatury molekularne mogą dostarczyć nowych biologicznych spostrzeżeń w regulacji stanu zapalnego, metabolizmie energetycznym, odporności nowotworowej, plastyczności mięśni, starzeniu się i kruchości. Wszystkie te odkrycia pozwolą badaczom rozszyfrować mechanizmy wyjaśniające funkcjonalną i emocjonalną poprawę obserwowaną po ćwiczeniach.

      Co więcej, głęboka charakterystyka multi-omiczna dobrze scharakteryzowanej i zdefiniowanej kohorty pacjentów dostarczy nowych zestawów danych, które mogą być bardzo przydatne do dalszych badań biomedycznych i stanowić odniesienie dla społeczności naukowej.

      Z klinicznego punktu widzenia, systematyczna i dokładna integracja zestawów danych molekularnych i klinicznych umożliwi opracowanie modeli predykcyjnej odpowiedzi, które pomogą ocenić skuteczność interwencji ćwiczeniowych u każdego pacjenta i nowotworu, nazwanych precyzyjnymi ćwiczeniami.

      Podsumowując, projekt PEPOH dostarczy translacyjnych dowodów wspierających włączenie ćwiczeń jako spersonalizowanej i opłacalnej interwencji adiuwantowej w ramach kompleksowego podejścia do pacjentów z nowotworem, przyczyniając się do rozwoju precyzyjnej onkologii.

      Projekt badania PEPOH to randomizowane, kontrolowane badanie kliniczne. Badanie będzie prowadzone w Szpitalu Uniwersyteckim w Salamance, przy wsparciu technicznym i naukowym FIBSAL.

      Populacja

      Badanie obejmie pięć kohort pacjentów odpowiadających następującym diagnozom: rak płuca, rak jelita grubego, rak piersi, przewlekła białaczka limfocytowa i szpiczak mnogi. Każda kohorta będzie liczyć 50 pacjentów, co daje całkowitą próbę 250 pacjentów. Po ocenie wyjściowej pacjenci zostaną losowo przydzieleni (1:1) do jednej z dwóch grup badawczych:

      Grupa interwencji nadzorowanej: program treningu siłowego prowadzony dwa razy w tygodniu przez 12 tygodni pod profesjonalnym nadzorem, uzupełniony programem ćwiczeń domowych.

      Grupa kontrolna: program ćwiczeń domowych zgodny z tymi samymi zaleceniami i wytycznymi co grupa nadzorowana, ale bez nadzorowanych sesji osobistych.

      Oceny będą przeprowadzane na początku oraz po 12-tygodniowej interwencji, z dodatkową obserwacją po 6 miesiącach w celu analizy utrzymywania się klinicznych i molekularnych efektów w średnim terminie.

      Kryteria włączenia:

      • Dorośli pacjenci (≥18 lat), zdolni do podpisania świadomej zgody i chętni do udziału w badaniu.
      • Stan sprawności (ECOG) 0-2.

      Specyficzne kryteria włączenia są zdefiniowane dla każdej kohorty uczestniczącej w badaniu następująco:

      Rak płuca: Pacjenci z rozpoznaniem niedrobnokomórkowego raka płuca w stadium przerzutowym, kwalifikujący się do skojarzonej immunoterapii i chemioterapii, poddawani aktywnej terapii.

      Rak jelita grubego: Pacjenci z rakiem jelita grubego w stadium II, III lub IV po resekcji, poddawani chemioterapii adiuwantowej.

      Rak piersi: Pacjentki z histologicznie potwierdzonym hormonozależnym rakiem piersi ujemnym w kierunku HER2, otrzymujące aktywną terapię hormonalną (tamoksyfen, inhibitor aromatazy lub fulwestrant) w fazie adiuwantowej lub stabilnej przerzutowej.

      Przewlekła białaczka limfocytowa (CLL): Pacjenci z rozpoznaniem CLL, którzy nie otrzymywali i nie wymagają leczenia farmakologicznego.

      Szpiczak mnogi (MM): Pacjenci z potwierdzonym nowym rozpoznaniem MM poddawani aktywnej terapii pierwszej linii i niekwalifikujący się do autologicznego przeszczepienia.

      Kryteria wykluczenia:

      Obecność niestabilnych przerzutów do kości lub rozległego zajęcia kości związanych z wysokim ryzykiem złamania.

      Niekontrolowane choroby sercowo-naczyniowe, oddechowe, mięśniowo-szkieletowe lub metaboliczne, które, według uznania badacza, przeciwskazują aktywność fizyczną.

      Wyraźne przeciwwskazanie medyczne do treningu ćwiczeń. Udokumentowane słabe przestrzeganie (<80%). Przerwanie leczenia, progresja choroby, nietolerancja lub jakakolwiek inna okoliczność medyczna, osobista lub logistyczna, która, według opinii badaczy, może zagrozić bezpieczeństwu uczestnika lub integralności badania.

      Wielkość próby Do oceny wielkości próby badania wybrano projekt ANOVA z dwoma czynnikami: czynnikiem międzyosobniczym (grupy kontrolna i interwencyjna) i czynnikiem wewnątrzosobniczym (pomiar przed-po i sześciomiesięczna obserwacja). Wymagana całkowita wielkość próby wynosiłaby 42, przy założeniu wielkości efektu f=0,20, poziomu istotności 5%, mocy 80% i korelacji między pomiarami powtarzanymi 0,5. Szacuje się, że może wystąpić 20% utraty do obserwacji między dwiema grupami eksperymentalnymi, dlatego całkowita wielkość próby wynosi 50 osób na kohortę.

      Metodologia Próbki biologiczne badania Próbki krwi obwodowej (jedna probówka EDTA 10 mL) będą pobierane w trzech punktach czasowych: 1) przed rozpoczęciem programu; 2) po 12 tygodniach interwencji; 3) po 6 miesiącach obserwacji. Izolowane mononuklearne komórki krwi obwodowej (PBMC), surowica i osocze będą odpowiednio przechowywane w biobanku IBSAL w warunkach standaryzowanych.

      Charakterystyka proteomiczna Ilościowa analiza proteomiczna osocza za pomocą technologii PreOmics® ENRICHplus, a następnie chromatografia cieczowa sprzężona ze spektrometrią mobilności jonowej (LC-IMS/MS), co umożliwi powtarzalną i wysoce czułą analizę z minimalnej objętości osocza (50µL). Ilościowa analiza proteomiczna eluowanych peptydów zostanie przeprowadzona na systemie LC Evosep One (Evosep Biosystems, Dania), sprzężonym z MS timsTOF Pro 2 (Bruker Corporation, USA), z zastosowaniem metody separacji 60 próbek/dzień. Zastosowane zostanie podejście DIA-PASEF z zakresem masy/ładunku 100 do 1700 i zakresem mobilności jonowej 0,85-1,30 1/K0, z czasem cyklu 100ms.

      Immunofenotypowanie Do analiz populacji immunologicznych (cel 1) badacze użyją panelu obejmującego przeciwciała przeciwko CD45, CD3, CD4, CD8, CD5, CD7, TCR, CD27, CD45RA, CD127, CD25RA, CD56, HLA-DR, CD11c, CD123, CD33, CD14 i CD16 z minimalnym pozyskaniem 500 000 zdarzeń. Ten panel umożliwi identyfikację różnych subpopulacji limfocytów T, komórek NK, komórek dendrytycznych i monocytów. Do analizy komórek B zastosujemy strategię przesiewową LST opisaną przez EuroFlow. Wszystkie analizy będą przeprowadzane za pomocą cytometru 8-kolorowego FACScanto i oprogramowania Infinicyt. Wszystkie próbki będą przetwarzane w Ogólnouniwersyteckiej Pracowni Cytometrii Przepływowej Uniwersytetu w Salamance (www.nucleus.usal.es) oraz w Katedrze Hematologii.

      Profilowanie metabolomiczne Białka osocza będą strącane metanolem, a glicerofosfolipidy ekstrahowane przez SPE. Po filtracji każdy roztwór zostanie doprowadzony do 600 µL z D₂O i przeniesiony do probówek NMR 5 mm. Analizy NMR będą przeprowadzane w 298 K na spektrometrze Bruker Avance Neo 400 MHz z kriosondą. Parametry zostaną zoptymalizowane do ilościowego oznaczania metabolitów przy użyciu Chenomx NMR Suite 10 (Chenomx, Edmonton, Kanada). Identyfikacja i ilościowe oznaczanie metabolitów zostaną przeprowadzone za pomocą tego oprogramowania, które umożliwia wiarygodną dekonwolucję i określanie stężeń w złożonych widmach. Przypisania pików protonowych zostaną dodatkowo zweryfikowane przez porównanie przesunięć chemicznych z Bazą Danych Metabolomu Ludzkiego (http://www.hmdb.ca).

      Analiza transkryptomiczna i genomowa Ekstrakcja cfRNA i DNA Ekstrakcja cfRNA z osocza zostanie przeprowadzona przy użyciu zestawu miRNeasy Serum/Plasma Advanced Kit (Qiagen), zoptymalizowanego dla niskiej wydajności i krótkich fragmentów RNA. Stężenie i czystość RNA zostaną określone fluorometrycznie przy użyciu testu Qubit RNA HS Assay (Invitrogen). ctDNA z osocza zostanie ekstrahowane przy użyciu zestawu QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit (Qiagen, Hilden, Niemcy). Genomiczne DNA (gDNA) zostanie wyizolowane z krwi obwodowej przy użyciu zestawu QIAamp DNA Blood Midi Kit (Qiagen, Niemcy) zgodnie ze standardowymi protokołami.

      Przygotowanie bibliotek i sekwencjonowanie Biblioteki cfRNA zostaną wygenerowane przy użyciu zestawu Qiagen QIAseq cfRNA All-in-One Kit, zoptymalizowanego dla niskiej ilości RNA i krótkich fragmentów. Sekwencjonowanie zostanie przeprowadzone na sekwenatorze NovaSeq X (Illumina, San Diego, CA, USA), produkując odczyty sparowane 150bp (2×150bp) ze średnią głębokością większą niż 50 milionów odczytów, aby zmaksymalizować wykrywanie transkryptów o niskiej liczebności. Przygotowanie bibliotek i sekwencjonowanie ctDNA i gDNA zostanie przeprowadzone przy użyciu zestawu przechwytywania SureSelect V6 (Agilent, Santa Clara, CA, USA) i technologii Illumina (NovaSeq 6000, 150PE 2×150bp), osiągając średnią głębokość sekwencjonowania 18Gb/próbkę.

      Analiza bioinformatyczna Jakość plików FASTQ uzyskanych z sekwencjonowania zostanie oceniona za pomocą FastQC (Narzędzie Kontroli Jakości dla Danych Sekwencji o Wysokiej Przepustowości). Surowe odczyty przejdą kontrolę jakości z FastQC i MultiQC, następnie przycinanie adapterów i usuwanie odczytów o niskiej jakości przy użyciu Trimmomatic. Alignowanie do ludzkiego genomu referencyjnego (GRCh38) zostanie wykonane za pomocą STAR (v2.7), a obfitość genów skwantowana przy użyciu featureCounts (pakiet Subread). Normalizacja i analiza różnicowej ekspresji zostaną przeprowadzone przy użyciu DESeq2 (Bioconductor), stosując skorygowane wartości p <0,05 jako próg istotności. Analizy wzbogacenia funkcjonalnego i szlakowego zostaną przeprowadzone za pomocą clusterProfiler, GOplot i GSEA. Różnicowo ekspresjonowane geny zostaną zwalidowane przez odwrotną transkrypcję i ilościową PCR w czasie rzeczywistym.

      Analiza genomowa Sparowane odczyty zostaną zalignowane do ludzkiego genomu (GRCh37) przy użyciu BWA-MEM (v0,7,17). Otrzymane pliki SAM zostaną przetworzone w celu poprawy efektywności dalszych analiz, w tym usunięcia duplikatów przy użyciu MarkDuplicatesSpark (GATK). Rekalibracja wyników jakości baz zostanie przeprowadzona za pomocą BaseRecalibrator i ApplyBQSR (GATK). Wywoływanie wariantów somatycznych zostanie przeprowadzone za pomocą Mutect2 (GATK, tryb sparowany), a następnie filtrowanie przy użyciu FilterMutectCalls. Warianty germinalne (SNV i INDEL) zostaną zidentyfikowane za pomocą HaplotypeCaller i przefiltrowane przy użyciu twardych filtrów. Wybrane warianty zostaną opisane za pomocą Funcotator, a patogenność wariantów oceniona za pomocą Varank (v1.4.3). Częstotliwość i rozkład wykrytych SNV i INDEL zostaną porównane z bazami danych zdrowych dawców (NHLBI-ESP i gnomAD) przy użyciu ANNOVAR.

      Integracja multi-omics Dane omiczne zostaną zintegrowane przy użyciu potoków opracowanych przez Jednostkę Bioinformatyki IBSAL. Zostaną zastosowane narzędzia uczenia maszynowego (Random Forest, SVM) i analiza sieci (Weighted Gene Co-expression Network Analysis, WGCNA) w celu identyfikacji wspólnych i specyficznych dla typu nowotworu wzorców molekularnych. Analiza Czynników Multi-Omicznych (MOFA). Integracja danych multi-omicznych i klinicznych umożliwi opracowanie modeli predykcyjnych odpowiedzi na aktywność fizyczną.

      Oceny kliniczne, funkcjonalne i psychologiczne Wszystkie wyniki kliniczne i funkcjonalne będą zbierane w trzech punktach czasowych: 1) przed rozpoczęciem programu, 2) po 12 tygodniach interwencji, 3) po 6 miesiącach obserwacji.

      We wszystkich przypadkach wszyscy uczestnicy będą oceniani: Siła mięśni (dynamometria), skład ciała (Tanita BC-418), stan funkcjonalny (Krótka Bateria Sprawności Fizycznej), jakość życia (EORTC QLQ-C30), Dobrostan psychiczny (Szpitalna skala lęku i depresji), jakość snu (Ateńska skala bezsenności), poziom aktywności fizycznej (Międzynarodowy Kwestionariusz Aktywności Fizycznej).

      Interwencja Interwencja obu grup (program treningu siłowego i program ćwiczeń domowych) jest szczegółowo opisana w opublikowanych protokołach badania.