Exercício Físico de Precisão para Onco-Hematologia Personalizada. (PEPOH)

O principal objetivo do projeto PEPOH é caracterizar e prever a resposta clínica ao treino de força em tumores sólidos e/ou hematológicos em doentes (sob terapia ativa e/ou durante o processo terapêutico) através de uma integração exaustiva e sistemática de conjuntos de dados multi-ómicos para determinar assinaturas associadas à tolerância ao tratamento, progressão da doença e sobrevivência global.

Deste objetivo principal derivam vários objetivos específicos:

1. - Determinar o efeito imunomodulador do exercício físico através da decifração de perfis moleculares diferenciais no sangue periférico por sequenciação de nova geração (RNA, SNPs, CHIP), proteómica e metabolómica, que fornecem novos insights para uma análise abrangente do efeito do exercício nos doentes.

2. - Avaliar o impacto de um programa de exercício físico em doentes oncohematológicos em indicadores multidimensionais da sua capacidade intrínseca relacionados com a qualidade de vida global:

   1. - Condição física funcional (força muscular, velocidade de marcha, equilíbrio e fadiga).
   2. - Bem-estar psicológico e saúde mental.
   3. - Composição corporal e variáveis antropométricas.

   4. - Qualidade do sono, qualidade de vida global e qualidade de vida relacionada com o cancro.

      Todos estes objetivos respondem a três prioridades principais na oncologia atual:

      1. Compreender os mecanismos fisiológicos e moleculares subjacentes aos efeitos terapêuticos do exercício.
      2. Gerar evidência robusta em populações altamente vulneráveis e sub-representadas, como os doentes com cancro hematológico.
      3. Estabelecer as bases para incorporar o treino de força como uma intervenção adjuvante padronizada na gestão clínica do cancro.

      O valor acrescentado do PEPOH reside na sua abordagem translacional e multidisciplinar, que combina ciência básica com prática clínica, biologia molecular com fisiologia do exercício, e análise multi-ómica com avaliação abrangente do doente. Através deste enquadramento, o projeto visa contribuir para uma mudança de paradigma nos cuidados oncológicos, integrando o exercício físico como uma ferramenta terapêutica personalizada capaz de melhorar a sobrevivência, o bem-estar e a qualidade de vida em pessoas com cancro.

      Tendo em conta o aspeto multidisciplinar do projeto PEPOH, a impressão digital molecular - obtida pela caracterização multi-ómica - de doentes oncohematológicos sob treino de força será um ativo para fornecer a base biológica do seu uso terapêutico, uma vez que está relacionada com a tolerância ao tratamento e sobrevivência. Adicionalmente, estas assinaturas moleculares poderão fornecer novos insights biológicos na regulação da inflamação, metabolismo energético, imunidade tumoral, plasticidade muscular, envelhecimento e fragilidade. Todos estes achados permitirão aos investigadores decifrar mecanismos que expliquem a melhoria funcional e emocional observada após o exercício.

      Além disso, a profunda caracterização multi-ómica de uma coorte bem caracterizada e definida de doentes fornecerá novos conjuntos de dados, que poderão ser altamente úteis para futuros estudos biomédicos e uma referência para a comunidade científica.

      Do ponto de vista clínico, a integração sistemática e precisa de conjuntos de dados moleculares e clínicos permitirá o desenvolvimento de modelos preditivos de resposta que ajudem a avaliar a eficácia das intervenções de exercício para cada doente e tumor, denominado exercício de precisão.

      Em resumo, o projeto PEPOH fornecerá evidência translacional para apoiar a incorporação do exercício como uma intervenção adjuvante personalizada e custo-efetiva na abordagem abrangente a doentes com cancro, contribuindo para o desenvolvimento da oncologia de precisão.

      Desenho do Estudo O PEPOH é um ensaio clínico randomizado e controlado. O estudo será realizado no Hospital Universitário de Salamanca, com o apoio técnico e científico da FIBSAL.

      População

      O ensaio incluirá cinco coortes de doentes correspondentes aos seguintes diagnósticos: cancro do pulmão, cancro colorretal, cancro da mama, leucemia linfocítica crónica e mieloma múltiplo. Cada coorte consistirá em 50 doentes, resultando numa amostra total de 250 doentes. Após uma avaliação basal, os doentes serão aleatoriamente atribuídos (1:1) a um de dois grupos de estudo:

      Grupo de intervenção supervisionada: um programa de treino de força realizado duas vezes por semana durante 12 semanas sob supervisão profissional, complementado por um programa de exercício domiciliário.

      Grupo de controlo: um programa de exercício domiciliário seguindo as mesmas recomendações e diretrizes do grupo supervisionado, mas sem sessões presenciais supervisionadas.

      As avaliações serão realizadas no início e após as 12 semanas de intervenção, com um seguimento adicional aos 6 meses para analisar a persistência dos efeitos clínicos e moleculares a médio prazo.

      Critérios de inclusão:

      • Doentes adultos (≥18 anos), capazes de assinar o consentimento informado e dispostos a participar no estudo.
      • Estado de performance (ECOG) 0-2.

      Critérios de inclusão específicos são definidos para cada coorte envolvida no estudo da seguinte forma:

      Cancro do pulmão: Doentes diagnosticados com carcinoma de pulmão de não pequenas células em estadio metastático, elegíveis para imunoterapia combinada e quimioterapia, com tratamento ativo.

      Cancro colorretal: Doentes com cancro colorretal ressecado em estadio II, III ou IV, submetidos a quimioterapia adjuvante.

      Cancro da mama: Doentes do sexo feminino com cancro da mama positivo para recetores hormonais/HER2-negativo confirmado histologicamente, a receber terapia hormonal ativa (tamoxifeno, inibidor da aromatase ou fulvestrante) em fase adjuvante ou metastática estável.

      Leucemia linfocítica crónica (LLC): Doentes diagnosticados com LLC que não tenham recebido e não necessitem de tratamento farmacológico.

      Mieloma múltiplo (MM): Doentes com novo diagnóstico confirmado de MM sob tratamento ativo de primeira linha e não candidatos a transplante autólogo.

      Critérios de exclusão:

      Presença de metástases ósseas instáveis ou envolvimento ósseo extenso associado a alto risco de fratura.

      Doenças cardiovasculares, respiratórias, musculoesqueléticas ou metabólicas não controladas que contraindicam o exercício físico a critério do investigador.

      Contraindicação médica explícita para treino de exercício. Adesão documentada insuficiente (<80%). Descontinuação do tratamento, progressão da doença, intolerância ou qualquer outra circunstância médica, pessoal ou logística que, na opinião dos investigadores, possa comprometer a segurança do participante ou a integridade do estudo.

      Tamanho da Amostra Foi escolhido um desenho ANOVA de dois fatores com um fator interindividual (grupos de controlo e intervenção) e um fator intraindividual (pré-pós e seguimento de seis meses) para avaliar o tamanho da amostra do estudo. O tamanho total da amostra necessário seria de 42, considerando um tamanho de efeito de f=0,20, um nível de significância de 5%, um poder de 80% e uma correlação entre medidas repetidas de 0,5. Estima-se que possa haver uma perda de seguimento de 20% entre os dois grupos experimentais e, portanto, o tamanho total da amostra é de 50 indivíduos por coorte.

      Metodologia Amostras biológicas do estudo Amostras de sangue periférico (um tubo de EDTA de 10 mL) serão recolhidas em três momentos: 1) antes de iniciar o programa; 2) após 12 semanas de intervenção; 3) seguimento de 6 meses. Células mononucleares do sangue periférico isoladas (PBMCs), soro e plasma, que serão devidamente preservadas na biobanco do IBSAL sob condições padronizadas.

      Caracterização Proteómica Análise proteómica quantitativa do plasma pela tecnologia PreOmics® ENRICHplus, seguida de cromatografia líquida acoplada a espectrometria de mobilidade iónica (LC-IMS/MS), que permitirá uma análise reprodutível e altamente sensível a partir de um volume mínimo de plasma (50µL).

      A análise proteómica quantitativa dos péptidos eluídos será realizada num sistema LC Evosep One (Evosep Biosystems, Dinamarca), acoplado a um MS timsTOF Pro 2 (Bruker Corporation, EUA), utilizando um método de separação de 60 amostras/dia. Será aplicada uma abordagem DIA-PASEF com uma gama de massa/carga de 100 a 1700 e uma gama de mobilidade iónica de 0,85-1,30 1/K0, com um tempo de ciclo de 100ms.

      Imunofenotipagem Para análises de populações imunes (objetivo 1), os investigadores utilizarão um painel incluindo anticorpos contra CD45, CD3, CD4, CD8, CD5, CD7, TCR, CD27, CD45RA, CD127, CD25RA, CD56, HLA-DR, CD11c, CD123, CD33, CD14 e CD16 com uma aquisição mínima de 500.000 eventos. Este painel permitirá a identificação de diferentes subpopulações de linfócitos T, células NK, células dendríticas e monócitos. Para análise de células B, empregaremos a estratégia de rastreio LST conforme descrito pelo EuroFlow. Todas as análises serão realizadas utilizando um citómetro FACScanto de 8 cores e software Infinicyt. Todas as amostras serão processadas no Serviço Geral de Citometria de Fluxo da Universidade de Salamanca (www.nucleus.usal.es) e no Departamento de Hematologia.

      Perfil Metabolómico As proteínas plasmáticas serão precipitadas com metanol, e os glicerofosfolípidos extraídos por SPE. Após filtração, cada solução será ajustada para 600 µL com D₂O e transferida para tubos de RMN de 5 mm. As análises de RMN serão realizadas a 298 K num espetrómetro Bruker Avance Neo 400 MHz com uma cryosonda. Os parâmetros serão otimizados para quantificação de metabolitos utilizando o Chenomx NMR Suite 10 (Chenomx, Edmonton, Canadá). A identificação e quantificação de metabolitos serão realizadas com este software, que permite uma desconvolução fiável e determinação de concentração em espetros complexos. As atribuições de picos de protão serão validadas adicionalmente comparando desvios químicos com a Human Metabolome Database (http://www.hmdb.ca).

      Análise Transcriptómica e Genómica Extração de cfRNA e DNA plasmático A extração de cfRNA plasmático será realizada utilizando o kit miRNeasy Serum/Plasma Advanced (Qiagen), otimizado para fragmentos de RNA de baixo rendimento e curtos. A concentração e pureza do RNA serão determinadas fluorometricamente utilizando o ensaio Qubit RNA HS (Invitrogen). O ctDNA plasmático será extraído utilizando o kit QIAamp Circulating Nucleic Acid (Qiagen, Hilden, Alemanha). O DNA genómico (gDNA) será isolado do sangue periférico utilizando o kit QIAamp DNA Blood Midi (Qiagen, Alemanha) seguindo protocolos padrão.

      Preparação de Bibliotecas e Sequenciação As bibliotecas de cfRNA serão geradas utilizando o kit Qiagen QIAseq cfRNA All-in-One, otimizado para baixa quantidade de RNA e fragmentos curtos. A sequenciação será realizada num sequenciador NovaSeq X (Illumina, San Diego, CA, EUA), produzindo leituras paired-end de 150pb (2×150pb) com uma profundidade média superior a 50 milhões de leituras para maximizar a deteção de transcritos de baixa abundância.

      A preparação e sequenciação de bibliotecas de ctDNA e gDNA serão conduzidas utilizando o kit de captura SureSelect V6 (Agilent, Santa Clara, CA, EUA) e tecnologia Illumina (NovaSeq 6000, 150PE 2×150pb), atingindo uma profundidade média de sequenciação de 18Gb/amostra.

      Análise Bioinformática A qualidade dos ficheiros FASTQ obtidos da sequenciação será avaliada com FastQC (Quality Control Tool for High Throughput Sequence Data). As leituras brutas serão submetidas a controlo de qualidade com FastQC e MultiQC, seguido de trimming de adaptadores e remoção de leituras de baixa qualidade utilizando Trimmomatic. O alinhamento ao genoma de referência humano (GRCh38) será realizado com STAR (v2.7), e a abundância génica quantificada utilizando featureCounts (pacote Subread). A normalização e análise de expressão diferencial serão realizadas utilizando DESeq2 (Bioconductor), aplicando valores p ajustados <0,05 como limiar de significância. As análises de enriquecimento funcional e de vias serão conduzidas com clusterProfiler, GOplot e GSEA. Genes diferencialmente expressos serão validados por transcrição reversa e PCR quantitativo em tempo real.

      Análise Genómica As leituras paired-end serão alinhadas ao genoma humano (GRCh37) utilizando BWA-MEM (v0.7.17). Os ficheiros SAM resultantes serão processados para melhorar a eficiência das análises subsequentes, incluindo remoção de duplicados utilizando MarkDuplicatesSpark (GATK). A recalibração da pontuação de qualidade da base será realizada com BaseRecalibrator e ApplyBQSR (GATK). A chamada de variantes somáticas será conduzida com Mutect2 (GATK, modo paired), seguida de filtragem utilizando FilterMutectCalls. Variantes germinativas (SNVs e INDELs) serão identificadas com HaplotypeCaller e filtradas utilizando filtros rígidos. As variantes selecionadas serão anotadas com Funcotator, e a patogenicidade das variantes avaliada com Varank (v1.4.3). A frequência e distribuição dos SNVs e INDELs detetados serão comparadas com bases de dados de dadores saudáveis (NHLBI-ESP e gnomAD) utilizando ANNOVAR.

      Integração Multi-Ómica Os dados ómicos serão integrados utilizando pipelines desenvolvidos pela Unidade de Bioinformática do IBSAL. Ferramentas de machine learning (Random Forest, SVM) e análise de redes (Weighted Gene Co-expression Network Analysis, WGCNA) serão aplicadas para identificar padrões moleculares comuns e específicos do tipo de tumor. Análise de Fatores Multi-Ómicos (MOFA). A integração de dados multi-ómicos e clínicos permitirá o desenvolvimento de modelos preditivos de resposta ao exercício físico.

      Avaliações Clínicas, Funcionais e Psicológicas Todos os outcomes clínicos e funcionais serão recolhidos em três momentos: 1) antes de iniciar o programa, 2) após 12 semanas de intervenção, 3) seguimento de 6 meses.

      Em todos os casos, todos os indivíduos serão avaliados: Força muscular (Dinamometria), composição corporal (Tanita BC-418), estado funcional (Short Physical Performance Battery), qualidade de vida (EORTC QLQ-C30), Bem-estar psicológico (Escala de ansiedade e depressão hospitalar), qualidade do sono (Escala de insónia de Atenas), nível de atividade física (Questionário Internacional de Atividade Física).

      Intervenção A intervenção de ambos os grupos (programa de treino de força e programa de exercício domiciliário) está detalhada nos protocolos de estudo publicados.