Точная физическая нагрузка для персонализированной онкогематологии. (PEPOH)

Основной целью проекта PEPOH является характеристика и прогнозирование клинического ответа на силовые тренировки у пациентов с солидными и/или гематологическими опухолями (находящихся на активной терапии и/или в процессе лечения) путем всестороннего и систематического интеграции мульти-омиксных наборов данных для определения сигнатур, связанных с переносимостью лечения, прогрессированием заболевания и общей выживаемостью.

Из этой основной цели вытекает несколько конкретных задач:

1. - Определить иммуномодулирующий эффект физических упражнений путем расшифровки дифференциальных молекулярных профилей в периферической крови с помощью секвенирования нового поколения (РНК, SNP, CHIP), протеомики и метаболомики, что дает новые возможности для комплексного анализа влияния упражнений на пациентов.

2. - Оценить влияние программы физических упражнений у онкогематологических пациентов на многомерные показатели их внутренней способности, связанные с общим качеством жизни:

   1. - Функциональное физическое состояние (мышечная сила, скорость ходьбы, баланс и усталость).
   2. - Психологическое благополучие и психическое здоровье.
   3. - Состав тела и антропометрические переменные.

   4. - Качество сна, общее качество жизни и качество жизни, связанное с раком.

      Все эти задачи отвечают трем основным приоритетам современной онкологии:

      1. понять физиологические и молекулярные механизмы, лежащие в основе терапевтических эффектов физических упражнений.
      2. создать надежные доказательства для высоко уязвимых и недостаточно представленных групп населения, таких как пациенты с гематологическими злокачественными новообразованиями.
      3. заложить основу для включения силовых тренировок в качестве стандартизированного адъювантного вмешательства в клиническое ведение рака.

      Добавленная стоимость PEPOH заключается в его трансляционном и междисциплинарном подходе, который сочетает фундаментальную науку с клинической практикой, молекулярную биологию с физиологией упражнений, а мульти-омиксный анализ — с всесторонней оценкой пациента. В рамках этого подхода проект направлен на содействие смене парадигмы в онкологической помощи путем интеграции физических упражнений как персонализированного терапевтического инструмента, способного улучшить выживаемость, благополучие и качество жизни людей с раком.

      Учитывая междисциплинарный аспект проекта PEPOH, молекулярный отпечаток, полученный с помощью мульти-омиксной характеристики, у онкогематологических пациентов, проходящих силовые тренировки, станет активом для предоставления биологической основы его терапевтического использования, поскольку он связан с переносимостью лечения и выживаемостью. Кроме того, эти молекулярные сигнатуры могут дать новые биологические сведения о регуляции воспаления, энергетическом метаболизме, противоопухолевом иммунитете, мышечной пластичности, старении и слабости. Все эти находки позволят исследователям расшифровать механизмы, объясняющие функциональное и эмоциональное улучшение, наблюдаемое после упражнений.

      Более того, глубокая мульти-омиксная характеристика хорошо охарактеризованной и определенной когорты пациентов предоставит новые наборы данных, которые могут быть чрезвычайно полезны для дальнейших биомедицинских исследований и станут ориентиром для научного сообщества.

      С клинической точки зрения, систематическая и точная интеграция молекулярных и клинических наборов данных позволит разработать модели прогнозирования ответа, которые помогут оценить эффективность вмешательств с помощью упражнений для каждого пациента и опухоли, что называется точными упражнениями.

      Таким образом, проект PEPOH предоставит трансляционные доказательства для поддержки включения упражнений в качестве персонализированного и экономически эффективного адъювантного вмешательства в комплексный подход к пациентам с раком, способствуя развитию точной онкологии.

      Дизайн исследования PEPOH — это рандомизированное контролируемое клиническое испытание. Исследование будет проводиться в Университетской больнице Саламанки при технической и научной поддержке FIBSAL.

      Популяция

      В исследование будут включены пять когорт пациентов, соответствующих следующим диагнозам: рак легкого, колоректальный рак, рак молочной железы, хронический лимфоцитарный лейкоз и множественная миелома. Каждая когорта будет состоять из 50 пациентов, что в сумме составит 250 пациентов. После базовой оценки пациенты будут случайным образом распределены (1:1) в одну из двух исследовательских групп:

      Группа супервизируемого вмешательства: программа силовых тренировок, проводимая два раза в неделю в течение 12 недель под профессиональным наблюдением, дополненная программой домашних упражнений.

      Контрольная группа: программа домашних упражнений, следующая тем же рекомендациям и руководствам, что и супервизируемая группа, но без контролируемых очных сессий.

      Оценки будут проводиться на исходном уровне и после 12-недельного вмешательства, с дополнительным наблюдением через 6 месяцев для анализа устойчивости клинических и молекулярных эффектов в среднесрочной перспективе.

      Критерии включения:

      • Взрослые пациенты (≥18 лет), способные подписать информированное согласие и желающие участвовать в исследовании.
      • Общее состояние (ECOG) 0-2.

      Конкретные критерии включения определены для каждой когорты, участвующей в исследовании, следующим образом:

      Рак легкого: Пациенты с диагнозом немелкоклеточного рака легкого в метастатической стадии, подходящие для комбинированной иммунотерапии и химиотерапии, на активном лечении.

      Колоректальный рак: Пациенты с резектабельным колоректальным раком стадии II, III или IV, проходящие адъювантную химиотерапию.

      Рак молочной железы: Пациенты женского пола с гистологически подтвержденным гормон-положительным/HER2-отрицательным раком молочной железы, получающие активную гормональную терапию (тамоксифен, ингибитор ароматазы или фулвестрант) либо в адъювантной, либо в стабильной метастатической фазе.

      Хронический лимфоцитарный лейкоз (ХЛЛ): Пациенты с диагнозом ХЛЛ, которые не получали и не нуждаются в фармакологическом лечении.

      Множественная миелома (ММ): Пациенты с подтвержденным новым диагнозом ММ на активном лечении первой линии и не являющиеся кандидатами на аутологичную трансплантацию.

      Критерии исключения:

      Наличие нестабильных костных метастазов или обширного поражения костей, связанного с высоким риском перелома.

      Неконтролируемые сердечно-сосудистые, респираторные, опорно-двигательные или метаболические заболевания, которые, по мнению исследователя, противопоказаны для физических упражнений.

      Явные медицинские противопоказания к тренировкам. Документированная плохая приверженность (<80%). Прекращение лечения, прогрессирование заболевания, непереносимость или любые другие медицинские, личные или логистические обстоятельства, которые, по мнению исследователей, могут поставить под угрозу безопасность участника или целостность исследования.

      Размер выборки Для оценки размера выборки исследования был выбран дизайн двухфакторного дисперсионного анализа с межгрупповым фактором (контрольная и интервенционная группы) и внутригрупповым фактором (до-после и шестимесячное наблюдение). Требуемый общий размер выборки составит 42 человека, учитывая размер эффекта f=0,20, уровень значимости 5%, мощность 80% и корреляцию между повторными измерениями 0,5. Предполагается, что может произойти потеря 20% участников для наблюдения между двумя экспериментальными группами, поэтому общий размер выборки составляет 50 человек на когорту.

      Методология Биологические образцы исследования Образцы периферической крови (одна пробирка с ЭДТА объемом 10 мл) будут собираться в три момента времени: 1) до начала программы; 2) после 12 недель вмешательства; 3) через 6 месяцев наблюдения. Выделенные мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC), сыворотка и плазма будут должным образом сохранены в биобанке IBSAL в стандартизированных условиях.

      Протеомная характеристика Количественный протеомный анализ плазмы с использованием технологии PreOmics® ENRICHplus, за которым следует жидкостная хроматография, связанная с ионной подвижностной спектрометрией (LC-IMS/MS), что позволит проводить воспроизводимый и высокочувствительный анализ при минимальном объеме плазмы (50 мкл).

      Количественный протеомный анализ элюированных пептидов будет проводиться на системе LC Evosep One (Evosep Biosystems, Дания), связанной с масс-спектрометром timsTOF Pro 2 (Bruker Corporation, США), с использованием метода разделения 60 образцов/день. Будет применен подход DIA-PASEF с диапазоном массы/заряда от 100 до 1700 и диапазоном ионной подвижности от 0,85 до 1,30 1/K0, со временем цикла 100 мс.

      Иммунофенотипирование Для анализа иммунных популяций (задача 1) исследователи будут использовать панель, включающую антитела против CD45, CD3, CD4, CD8, CD5, CD7, TCR, CD27, CD45RA, CD127, CD25RA, CD56, HLA-DR, CD11c, CD123, CD33, CD14 и CD16, с минимальным захватом 500 000 событий. Эта панель позволит идентифицировать различные субпопуляции Т-лимфоцитов, NK-клеток, дендритных клеток и моноцитов. Для анализа В-клеток мы будем использовать стратегию скрининга LST, как описано EuroFlow. Все анализы будут проводиться с использованием 8-цветного цитометра FACScanto и программного обеспечения Infinicyt. Все образцы будут обрабатываться в Общей службе проточной цитометрии Университета Саламанки (www.nucleus.usal.es) и в отделении гематологии.

      Метаболомный профилирование Белки плазмы будут осаждаться метанолом, а глицерофосфолипиды экстрагироваться с помощью SPE. После фильтрации каждый раствор будет доведен до 600 мкл с D₂O и перенесен в ЯМР-трубки диаметром 5 мм. ЯМР-анализы будут проводиться при 298 K на спектрометре Bruker Avance Neo 400 МГц с криозондом. Параметры будут оптимизированы для количественного определения метаболитов с использованием Chenomx NMR Suite 10 (Chenomx, Эдмонтон, Канада). Идентификация и количественное определение метаболитов будут проводиться с помощью этого программного обеспечения, которое обеспечивает надежную деконволюцию и определение концентрации в сложных спектрах. Назначения протонных пиков будут дополнительно проверены путем сравнения химических сдвигов с базой данных метаболома человека (http://www.hmdb.ca).

      Транскриптомный и геномный анализ Экстракция cfRNA и ДНК Экстракция cfRNA из плазмы будет выполняться с использованием набора miRNeasy Serum/Plasma Advanced Kit (Qiagen), оптимизированного для низкого выхода и коротких фрагментов РНК. Концентрация и чистота РНК будут определяться флуориметрически с использованием анализа Qubit RNA HS Assay (Invitrogen). Плазменная ctDNA будет экстрагироваться с использованием набора QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit (Qiagen, Хильден, Германия). Геномная ДНК (gDNA) будет выделяться из периферической крови с использованием набора QIAamp DNA Blood Midi Kit (Qiagen, Германия) в соответствии со стандартными протоколами.

      Подготовка библиотек и секвенирование Библиотеки cfRNA будут создаваться с использованием набора Qiagen QIAseq cfRNA All-in-One Kit, оптимизированного для низкого входа РНК и коротких фрагментов. Секвенирование будет проводиться на секвенаторе NovaSeq X (Illumina, Сан-Диего, Калифорния, США), производящем парные чтения длиной 150 п.н. (2×150 п.н.) со средней глубиной более 50 миллионов чтений для максимизации обнаружения низкообильных транскриптов.

      Подготовка и секвенирование библиотек ctDNA и gDNA будут проводиться с использованием набора захвата SureSelect V6 (Agilent, Санта-Клара, Калифорния, США) и технологии Illumina (NovaSeq 6000, 150PE 2×150 п.н.), достигая средней глубины секвенирования 18 Гб/образец.

      Биоинформатический анализ Качество файлов FASTQ, полученных в результате секвенирования, будет оцениваться с помощью FastQC (инструмент контроля качества для данных высокопроизводительного секвенирования). Необработанные чтения пройдут контроль качества с помощью FastQC и MultiQC, за которым последует обрезка адаптеров и удаление низкокачественных чтений с использованием Trimmomatic. Выравнивание на референсный геном человека (GRCh38) будет выполнено с помощью STAR (v2.7), а количество генов будет количественно определено с использованием featureCounts (пакет Subread). Нормализация и анализ дифференциальной экспрессии будут проведены с использованием DESeq2 (Bioconductor), с применением скорректированных p-значений <0,05 в качестве порога значимости. Функциональный и обогащенный анализ путей будет проведен с помощью clusterProfiler, GOplot и GSEA. Гены с дифференциальной экспрессией будут валидированы с помощью обратной транскрипции и количественной ПЦР в реальном времени.

      Геномный анализ Парные чтения будут выровнены по геному человека (GRCh37) с использованием BWA-MEM (v0.7.17). Полученные SAM-файлы будут обработаны для повышения эффективности последующих анализов, включая удаление дубликатов с использованием MarkDuplicatesSpark (GATK). Калибровка оценок качества оснований будет выполнена с помощью BaseRecalibrator и ApplyBQSR (GATK). Вызов соматических вариантов будет проведен с помощью Mutect2 (GATK, парный режим), за которым последует фильтрация с использованием FilterMutectCalls. Герминальные варианты (SNV и INDEL) будут идентифицированы с помощью HaplotypeCaller и отфильтрованы с использованием жестких фильтров. Выбранные варианты будут аннотированы с помощью Funcotator, а патогенность вариантов оценена с помощью Varank (v1.4.3). Частота и распределение обнаруженных SNV и INDEL будут сравниваться с базами данных здоровых доноров (NHLBI-ESP и gnomAD) с использованием ANNOVAR.

      Интеграция мульти-омиксных данных Данные омиксных технологий будут интегрированы с использованием конвейеров, разработанных Биоинформатическим подразделением IBSAL. Будут применены инструменты машинного обучения (случайный лес, SVM) и сетевой анализ (взвешенный анализ коэкспрессионных сетей генов, WGCNA) для выявления общих и специфичных для типа опухоли молекулярных паттернов. Многофакторный анализ мульти-омиксных данных (MOFA). Интеграция мульти-омиксных и клинических данных позволит разработать прогностические модели ответа на физические упражнения.

      Клинические, функциональные и психологические оценки Все клинические и функциональные исходы будут собираться в три момента времени: 1) до начала программы, 2) после 12 недель вмешательства, 3) через 6 месяцев наблюдения.

      Во всех случаях все лица будут оценены: Мышечная сила (динамометрия), состав тела (Tanita BC-418), функциональный статус (Краткая батарея физической работоспособности), качество жизни (EORTC QLQ-C30), Психологическое благополучие (Госпитальная шкала тревоги и депрессии), качество сна (Афинская шкала бессонницы), уровень физической активности (Международный опросник физической активности).

      Вмешательство Вмешательство обеих групп (программа силовых тренировок и программа домашних упражнений) подробно описано в опубликованных протоколах исследования.