Tarkka fysikaalinen harjoittelu personoidulle onkohematologialle. (PEPOH)

PEPOH-projektin päätavoite on luonnehtia ja ennustaa vahvistusharjoittelun kliinistä vastetta kiinteissä ja/tai hematologisissa kasvaimissa potilailla (aktiivisen hoidon aikana ja/tai hoitoprosessin aikana) moni-omisten tietojoukkojen kattavan ja systemaattisen integroinnin avulla, jotta voidaan määrittää hoidon sietokyvyn, sairauden etenemisen ja kokonaiseloonjäämisen yhteydessä olevat signatuurit.

Useat erityistavoitteet johtuvat tästä päätavoitteesta:

1. - Määrittää fyysisen harjoittelun immunomodulaattorivaikutus selvittämällä erilaiset molekyyliprofiilit perifeerisessä veressä uuden sukupolven sekvensoinnilla (RNA, SNP:t, CHIP), proteomiikalla ja metabolomiikalla, jotka tarjoavat uusia näkemyksiä kattavaan harjoittelun vaikutusten analyysiin potilailla.

2. - Arvioida fyysisen harjoitusohjelman vaikutusta onkohematologisilla potilailla heidän moniulotteisiin sisäisen kapasiteetin indikaattoreihin, jotka liittyvät kokonaiselämänlaatuun:

   1. - Toiminnallinen fyysinen kunto (lihasten voima, kävelynopeus, tasapaino ja väsymys).
   2. - Psyykkinen hyvinvointi ja mielenterveys.
   3. - Kehon koostumus ja antropometriset muuttujat.

   4. - Unenlaatu, kokonaiselämänlaatu ja syöpään liittyvä elämänlaatu.

      Kaikki nämä tavoitteet vastaavat kolmeen nykyisen onkologian pääprioriteettiin:

      1. Ymmärtää harjoittelun terapeuttisten vaikutusten taustalla olevat fysiologiset ja molekulaariset mekanismit.
      2. Tuottaa vankkaa näyttöä erittäin haavoittuvaisista ja aliedustetuista väestöryhmistä, kuten hematologisista syöpäpotilaista.
      3. Luoda perusta vahvistusharjoittelun sisällyttämiseksi standardoiduksi adjuvantiksi interventioksi syövän kliiniseen hoitoon.

      PEPOH-projektin lisäarvo piilee sen translatiivisessa ja monitieteisessä lähestymistavassa, joka yhdistää perustutkimuksen kliiniseen käytäntöön, molekyylibiologian harjoitusfysiologiaan ja moni-omisen analyysin kattavaan potilasarviointiin. Tämän viitekehyksen kautta projekti pyrkii edistämään paradigman muutosta onkologisessa hoidossa integroimalla fyysisen harjoittelun personoiduksi terapeuttiseksi työkaluksi, joka kykenee parantamaan syöpäpotilaiden eloonjäämistä, hyvinvointia ja elämänlaatua.

      PEPOH-projektin monitieteinen näkökulma huomioiden, onkohematologisten potilaiden vahvistusharjoittelun aikana moni-omisen karakterisoinnin avulla saatu molekyylinen sormenjälki on etu, joka tarjoaa biologisen perustan sen terapeuttiselle käytölle, koska se liittyy hoidon sietokykyyn ja eloonjäämiseen. Lisäksi nämä molekulaariset signatuurit voivat tarjota uusia biologisia näkemyksiä tulehduksen säätelyyn, energian aineenvaihduntaan, kasvaimen immuniteettiin, lihasten plastisuuteen, ikääntymiseen ja haurauteen. Kaikki nämä löydökset mahdollistavat tutkijoiden selvittää mekanismeja, jotka selittävät harjoittelun jälkeistä toiminnallista ja emotionaalista parantumista.

      Lisäksi hyvin karakterisoidun ja määritellyn potilaskohortin syvä moni-ominen karakterisointi tuottaa uusia tietojoukkoja, jotka voivat olla erittäin hyödyllisiä jatkobiologisille ja lääketieteellisille tutkimuksille sekä viitekehyksenä tieteelliselle yhteisölle.

      Kliinisestä näkökulmasta molekyylisten ja kliinisten tietojoukkojen systemaattinen ja tarkka integrointi mahdollistaa ennustavien vastemallien kehittämisen, jotka auttavat arvioimaan harjoitusinterventioiden tehoa kullekin potilaalle ja kasvaimelle, eli tarkkuusharjoittelua.

      Yhteenvetona PEPOH-projekti tarjoaa translatiivista näyttöä harjoittelun sisällyttämisen tukemiseksi personoituna ja kustannustehokkaana adjuvanttina interventiona syöpäpotilaiden kattavan hoidon osana, edistäen tarkkuusonkologian kehitystä.

      Tutkimussuunnittelu PEPOH on satunnaistettu, kontrolloitu kliininen tutkimus. Tutkimus toteutetaan Salamancan yliopistosairaalassa FIBSAL:n teknisen ja tieteellisen tuen avulla.

      Populaatio

      Tutkimus sisältää viisi potilaskohorttia, jotka vastaavat seuraavia diagnooseja: keuhkosyöpä, paksusuolen syöpä, rintasyöpä, krooninen lymfaattinen leukemia ja moninkertainen myeloma. Jokainen kohortti koostuu 50 potilaasta, mikä yhteensä on 250 potilasta. Perusarvioinnin jälkeen potilaat satunnaistetaan (1:1) yhteen kahdesta tutkimusryhmästä:

      Valvottu interventioryhmä: vahvistusharjoitusohjelma, jota toteutetaan kahdesti viikossa 12 viikon ajan ammattimaisen valvonnan alaisena, täydennettynä kotona tehtävällä harjoitusohjelmalla.

      Kontrolliryhmä: kotona tehtävä harjoitusohjelma, joka noudattaa samoja suosituksia ja ohjeita kuin valvottu ryhmä, mutta ilman valvottuja kasvokkain tapahtuvia istuntoja.

      Arvioinnit suoritetaan perustasolla ja 12 viikon interventioiden jälkeen, ja lisäksi seuranta 6 kuukauden kohdalla analysoidakseen kliinisten ja molekulaaristen vaikutusten pysyvyyttä keskipitkällä aikavälillä.

      Osallistumiskriteerit:

      • Aikuispotilaat (≥18 vuotta), jotka kykenevät allekirjoittamaan tietoon perustuvan suostumuksen ja ovat halukkaita osallistumaan tutkimukseen.
      • Suorituskykytila (ECOG) 0-2.

      Erityiset osallistumiskriteerit määritellään jokaiselle tutkimukseen osallistuvalle kohortille seuraavasti:

      Keuhkosyöpä: Potilaat, joilla on diagnosoitu ei-pienisoluinen keuhkosyöpä metastasoituneessa vaiheessa, jotka ovat kelvollisia yhdistetylle immunoterapialle ja kemoterapialle, ja joilla on aktiivinen hoito.

      Paksusuolen syöpä: Potilaat, joilla on vaiheen II, III tai IV resekoitu paksusuolen syöpä ja jotka saavat adjuvanttia kemoterapiaa.

      Rintasyöpä: Naispotilaat, joilla on histologisesti vahvistettu hormoni-reseptoripositiivinen/HER2-negatiivinen rintasyöpä, ja jotka saavat aktiivista hormonihoitoa (tamoksifeeni, aromataasi-inhibiittori tai fulvestrantti) joko adjuvanteissa tai stabiilissa metastasoituneessa vaiheessa.

      Krooninen lymfaattinen leukemia (CLL): Potilaat, joilla on diagnosoitu CLL ja jotka eivät ole saaneet eivätkä tarvitse farmakologista hoitoa.

      Moninkertainen myeloma (MM): Potilaat, joilla on vahvistettu uusi MM-diagnoosi ja jotka saavat aktiivista ensimmäisen linjan hoitoa eivätkä ole ehdokkaita autologiseen siirtoon.

      Poissulkemiskriteerit:

      Epävakaiden luumetastaasien tai laajan luukosketuksen läsnäolo, joka liittyy korkeaan murtumariskiin.

      Hallitsemattomat sydän- ja verisuoni-, hengitys-, liikunta- ja aineenvaihduntataudit, jotka tutkijan harkinnan mukaan estävät fyysisen harjoittelun.

      Nimenomainen lääketieteellinen harjoittelun vasta-aihe. Dokumentoitu huono sitoutuminen (<80 %). Hoidon keskeyttäminen, sairauden eteneminen, sietämättömyys tai mikä tahansa muu lääketieteellinen, henkilökohtainen tai logistinen seikka, joka tutkijoiden mielestä saattaa vaarantaa osallistujan turvallisuuden tai tutkimuksen eheyden.

      Otoskoko Tutkimuksen otoskokon arvioimiseksi valittiin kaksitekijäinen ANOVA-suunnittelu, jossa on yksilöiden välinen tekijä (kontrolli- ja interventioryhmät) ja yksilöiden sisäinen tekijä (ennen-jälkeen ja kuuden kuukauden seuranta). Vaadittu kokonaisotoskoko olisi 42, kun otetaan huomioon vaikutuksen koko f=0,20, merkitsevyystaso 5 %, voimakkuus 80 % ja toistomittausten välinen korrelaatio 0,5. Arvioidaan, että kahden kokeellisen ryhmän välillä voi olla 20 %:n seurantahäviö, ja siksi kokonaisotoskoko on 50 yksilöä per kohortti.

      Metodologia Biologiset näytteet Perifeerisen veren näytteet (yksi 10 ml EDTA-putki) kerätään kolmessa ajankohdassa: 1) ennen ohjelman aloittamista; 2) 12 viikon interventioiden jälkeen; 3) 6 kuukauden seuranta. Eristetyt perifeeriset veren mononukleaariset solut (PBMC:t), seerumi ja plasma, jotka säilytetään asianmukaisesti IBSAL:n biopankissa standardoiduissa olosuhteissa.

      Proteomiikan karakterisointi Plasmaan kvantitatiivinen proteomiikanalyysi PreOmics® ENRICHplus-teknologialla, jota seuraa nestekromatografia yhdistettynä ioniliikkuvuuspektrometriaan (LC-IMS/MS), mikä mahdollistaa toistettavan ja erittäin herkän analyysin minimaalisesta plasmatilavuudesta (50 µL).

      Eluoidun peptidien kvantitatiivinen proteomiikanalyysi suoritetaan LC Evosep One -järjestelmällä (Evosep Biosystems, Tanska), joka on kytketty MS timsTOF Pro 2:een (Bruker Corporation, USA), käyttäen erotusmenetelmää 60 näytettä/päivä. DIA-PASEF-lähestymistapaa sovelletaan massa/lataussuhteen alueella 100-1700 ja ioniliikkuvuusalueella 0,85-1,30 1/K0, sykliajalla 100 ms.

      Immunofenotypointi Immunipopulaatioanalyysien (tavoite 1) tutkijat käyttävät paneelia, joka sisältää vasta-aineita CD45:een, CD3:een, CD4:ään, CD8:aan, CD5:een, CD7:ään, TCR:ään, CD27:ään, CD45RA:han, CD127:ään, CD25RA:han, CD56:een, HLA-DR:ään, CD11c:hen, CD123:een, CD33:een, CD14:ään ja CD16:een vähimmäiskeräyksellä 500 000 tapahtumaa. Tämä paneeli mahdollistaa eri T-lymfosyyttien, NK-solujen, dendriittisten solujen ja monosyyttien alipopulaatioiden tunnistamisen. B-soluanalyysiä varten käytämme LST-seulontastrategiaa, kuten EuroFlow on kuvannut. Kaikki analyysit suoritetaan käyttäen 8-väristä FACScanto-sytometriä ja Infinicyt-ohjelmistoa. Kaikki näytteet käsitellään Salamancan yliopiston yleisessä virtaussytometriapalvelussa (www.nucleus.usal.es) ja hematologian osastolla.

      Metabolomiikan profiilointi Plasmaproteiinit saostetaan metanolilla, ja glyserofosfolipidit uutetaan SPE:llä. Suodatuksen jälkeen jokainen liuos säädetään 600 µL:ksi D₂O:lla ja siirretään 5 mm NMR-putkiin. NMR-analyysit suoritetaan 298 K:ssa Bruker Avance Neo 400 MHz -spektrometrillä kryo-anturilla. Parametrit optimoidaan metaboliittien kvantifiointiin käyttäen Chenomx NMR Suite 10 -ohjelmistoa (Chenomx, Edmonton, Kanada). Metaboliittien tunnistus ja kvantifiointi suoritetaan tällä ohjelmistolla, joka mahdollistaa luotettavan dekonvoluution ja pitoisuuden määrityksen monimutkaisissa spektreissä. Protonihuippujen osoitukset vahvistetaan edelleen vertaamalla kemiallisia siirtymiä Human Metabolome Databaseen (http://www.hmdb.ca).

      Transkriptomiikan ja genomiikan analyysi cfRNA:n ja DNA:n eristys Plasma-cfRNA:n eristys suoritetaan käyttäen miRNeasy Serum/Plasma Advanced -sarjaa (Qiagen), joka on optimoitu matalan tuoton ja lyhyiden RNA-fragmenttien osalta. RNA-pitoisuus ja puhtaus määritetään fluorometrisesti käyttäen Qubit RNA HS -testiä (Invitrogen).Plasma-ctDNA eristetään käyttäen QIAamp Circulating Nucleic Acid -sarjaa (Qiagen, Hilden, Saksa). Genomiininen DNA (gDNA) eristetään perifeerisestä verestä käyttäen QIAamp DNA Blood Midi -sarjaa (Qiagen, Saksa) noudattaen standardiprotokollia.

      Kirjastojen valmistelu ja sekvensointi cfRNA-kirjastot luodaan käyttäen Qiagen QIAseq cfRNA All-in-One -sarjaa, joka on optimoitu matalan RNA-syötön ja lyhyiden fragmenttien osalta. Sekvensointi suoritetaan NovaSeq X -sekvensoijalla (Illumina, San Diego, CA, USA), tuottaen 150 bp parillisia lukuja (2×150 bp) keskimääräisellä syvyydellä yli 50 miljoonaa lukumäärää maksimoidakseen matalan runsauden transkripttien havaitsemisen.

      ctDNA:n ja gDNA:n kirjastojen valmistelu ja sekvensointi suoritetaan käyttäen SureSelect V6 -kaappaussarjaa (Agilent, Santa Clara, CA, USA) ja Illumina-teknologiaa (NovaSeq 6000, 150PE 2×150 bp), saavuttaen keskimääräisen sekvensointisyvyyden 18 Gb/näyte.

      Bioinformatiikan analyysi Sekvensoinnista saatujen FASTQ-tiedostojen laatu arvioidaan FastQC:llä (Quality Control Tool for High Throughput Sequence Data). Raakatiedot käsitellään laadunvalvonnalla FastQC:llä ja MultiQC:llä, minkä jälkeen adapterit leikataan ja matalan laadun lukuja poistetaan Trimmomaticilla. Kohdistus ihmisen viitegenomiin (GRCh38) suoritetaan STAR:lla (v2.7), ja geenien runsaus kvantifioidaan featureCounts:illa (Subread-paketti). Normalisointi ja differentiaalinen ilmentymisanalyysi suoritetaan DESeq2:lla (Bioconductor), soveltaen korjattuja p-arvoja <0,05 merkitsevyysrajoina. Toiminnalliset ja reittien rikastumisanalyysit suoritetaan clusterProfiler:lla, GOplot:lla ja GSEA:lla. Differentiaalisesti ilmentyvät geenit validoidaan käänteistranskriptiolla ja kvantitatiivisella reaaliaikaisella PCR:llä.

      Genomiikan analyysi Parilliset lukukappaleet kohdistetaan ihmisen genomiin (GRCh37) käyttäen BWA-MEM:ää (v0.7.17). Tuloksena olevat SAM-tiedostot käsitellään parantaakseen myöhempien analyysien tehokkuutta, mukaan lukien kaksoiskappaleiden poisto MarkDuplicatesSpark:lla (GATK). Peruslaatupisteiden kalibrointi suoritetaan BaseRecalibrator:illa ja ApplyBQSR:lla (GATK). Somaattisten varianttien kutsunta suoritetaan Mutect2:lla (GATK, paritettu tila), minkä jälkeen suodatetaan FilterMutectCalls:lla. Sukusoluvariantit (SNV:t ja INDEL:t) tunnistetaan HaplotypeCaller:illa ja suodatetaan käyttäen kovia suodattimia. Valitut variantit annotoidaan Funcotator:illa, ja varianttien patogeenisuus arvioidaan Varank:lla (v1.4.3). Havaittujen SNV:iden ja INDEL:ien taajuus ja jakautuma verrataan terveiden verenluovuttajien tietokantoihin (NHLBI-ESP ja gnomAD) käyttäen ANNOVAR:ia.

      Moni-ominen integraatio Omiikka-tiedot integroidaan IBSAL:n bioinformatiikkayksikön kehittämien putkistojen avulla. Koneoppimistyökaluja (Random Forest, SVM) ja verkkoanalyysiä (Weighted Gene Co-expression Network Analysis, WGCNA) sovelletaan yhteisten ja kasvaintyypin erityisten molekulaaristen mallien tunnistamiseen. Moni-OMiikka-tekijäanalyysi (MOFA). Moni-omisten ja kliinisten tietojen integrointi mahdollistaa ennustavien mallien kehittämisen fyysisen harjoittelun vastetta varten.

      Kliiniset, toiminnalliset ja psykologiset arvioinnit Kaikki kliiniset ja toiminnalliset tulokset kerätään kolmessa ajankohdassa: 1) ennen ohjelman aloittamista, 2) 12 viikon interventioiden jälkeen, 3) 6 kuukauden seuranta.

      Kaikissa tapauksissa kaikkia yksilöitä arvioidaan: Lihasten voima (dynamometria), kehon koostumus (Tanita BC-418), toiminnallinen tila (Short Physical Performance Battery), elämänlaatu (EORTC QLQ-C30), psyykkinen hyvinvointi (sairaalan ahdistus- ja masennusasteikko), unenlaatu (Ateenan unettomuusasteikko), fyysisen aktiivisuuden taso (International Physical Activity Questionnaire).

      Interventio Molempien ryhmien interventio (vahvistusharjoitusohjelma ja kotona tehtävä harjoitusohjelma) on yksityiskohtaisesti kuvattu julkaistuissa tutkimusprotokollissa.