Precizní fyzické cvičení pro personalizovanou onko-hematologii. (PEPOH)

Hlavním cílem projektu PEPOH je charakterizovat a předpovědět klinickou odpověď na silový trénink u pacientů s pevnými a/nebo hematologickými nádory (podstupujících aktivní léčbu a/nebo v průběhu léčby) prostřednictvím důkladné a systematické integrace multi-omics datových souborů za účelem stanovení signatur spojených s tolerancí léčby, progresí onemocnění a celkovým přežitím.

Z tohoto hlavního cíle vyplývá několik specifických cílů:

1. - Stanovit imunomodulační účinek fyzické aktivity dešifrováním rozdílných molekulárních profilů v periferní krvi pomocí sekvenování nové generace (RNA, SNP, CHIP), proteomiky a metabolomiky, což poskytuje nové poznatky pro komplexní analýzu účinku cvičení na pacienty.

2. - Vyhodnotit dopad programu fyzické aktivity u onkohematologických pacientů na multidimenzionální ukazatele jejich vnitřní kapacity související s celkovou kvalitou života:

   1. - Funkční fyzická kondice (svalová síla, rychlost chůze, rovnováha a únava).
   2. - Psychická pohoda a duševní zdraví.
   3. - Složení těla a antropometrické proměnné.

   4. - Kvalita spánku, celková kvalita života a kvalita života související s rakovinou.

      Všechny tyto cíle reagují na tři hlavní priority současné onkologie:

      1. pochopit fyziologické a molekulární mechanismy, které jsou základem terapeutických účinků cvičení.
      2. generovat robustní důkazy u vysoce zranitelných a nedostatečně zastoupených populací, jako jsou pacienti s hematologickými nádory.
      3. stanovit základ pro začlenění silového tréninku jako standardizované adjuvantní intervence do klinického managementu rakoviny.

      Přidaná hodnota PEPOH spočívá v jeho translačním a multidisciplinárním přístupu, který kombinuje základní vědu s klinickou praxí, molekulární biologii s fyziologií cvičení a multi-omics analýzu s komplexním hodnocením pacienta. Prostřednictvím tohoto rámce projekt usiluje o přispění k posunu paradigmatu v onkologické péči integrací fyzické aktivity jako personalizovaného terapeutického nástroje schopného zlepšit přežití, pohodu a kvalitu života u lidí s rakovinou.

      S ohledem na multidisciplinární aspekt projektu PEPOH bude molekulární otisk – získaný multi-omics charakterizací – onkohematologických pacientů podstupujících silový trénink přínosem pro poskytnutí biologického základu jeho terapeutického využití, neboť souvisí s tolerancí léčby a přežitím. Kromě toho by tyto molekulární signatury mohly poskytnout nové biologické poznatky v regulaci zánětu, energetickém metabolismu, nádorové imunitě, svalové plasticitě, stárnutí a křehkosti. Všechna tato zjištění umožní výzkumníkům dešifrovat mechanismy, které vysvětlují funkční a emocionální zlepšení pozorované po cvičení.

      Navíc hluboká multi-omics charakterizace dobře charakterizované a definované kohorty pacientů poskytne nové datové soubory, které by mohly být velmi užitečné pro další biomedicínské studie a referenční materiál pro vědeckou komunitu.

      Z klinického hlediska umožní systematická a přesná integrace molekulárních a klinických datových souborů vývoj prediktivních modelů odpovědi, které pomohou vyhodnotit účinnost intervencí cvičení u každého pacienta a nádoru, tzv. precizní cvičení.

      Shrnuto, projekt PEPOH poskytne translační důkazy na podporu začlenění cvičení jako personalizované a nákladově efektivní adjuvantní intervence do komplexního přístupu k pacientům s rakovinou, čímž přispěje k rozvoji precizní onkologie.

      Studijní design PEPOH je randomizovaná, kontrolovaná klinická studie. Studie bude provedena na Univerzitní nemocnici v Salamance s technickou a vědeckou podporou FIBSAL.

      Populace

      Studie zahrne pět pacientských kohort odpovídajících následujícím diagnózám: rakovina plic, kolorektální karcinom, rakovina prsu, chronická lymfocytární leukémie a mnohočetný myelom. Každá kohorta bude sestávat z 50 pacientů, což vede k celkovému vzorku 250 pacientů. Po výchozím hodnocení budou pacienti náhodně rozděleni (1:1) do jedné ze dvou studijních skupin:

      Skupina se supervizovanou intervencí: program silového tréninku prováděný dvakrát týdně po dobu 12 týdnů pod odborným dohledem, doplněný o domácí cvičební program.

      Kontrolní skupina: domácí cvičební program dodržující stejná doporučení a pokyny jako supervizovaná skupina, ale bez osobních supervizovaných sezení.

      Hodnocení bude provedeno na začátku a po 12týdenní intervenci, s dalším sledováním po 6 měsících, aby se analyzovala perzistence klinických a molekulárních účinků v střednědobém horizontu.

      Inkluzní kritéria:

      • Dospělí pacienti (≥18 let), schopní podepsat informovaný souhlas a ochotní se studie zúčastnit.
      • Výkonnostní stav (ECOG) 0-2.

      Specifická inkluzní kritéria jsou definována pro každou kohortu zapojenou do studie takto:

      Rakovina plic: Pacienti s diagnózou nemalobuněčného karcinomu plic v metastatickém stádiu, vhodní pro kombinovanou imunoterapii a chemoterapii, s aktivní léčbou.

      Kolorektální karcinom: Pacienti s resekovaným kolorektálním karcinomem stádia II, III nebo IV podstupující adjuvantní chemoterapii.

      Rakovina prsu: Pacientky s histologicky potvrzeným hormonálně receptorově pozitivním/HER2-negativním karcinomem prsu, které dostávají aktivní hormonální terapii (tamoxifen, inhibitor aromatázy nebo fulvestrant) v adjuvantní fázi nebo ve stabilní metastatické fázi.

      Chronická lymfocytární leukémie (CLL): Pacienti s diagnózou CLL, kteří nedostali a nepotřebují farmakologickou léčbu.

      Mnohočetný myelom (MM): Pacienti s nově potvrzenou diagnózou MM podstupující aktivní léčbu první linie a nevhodní pro autologní transplantaci.

      Exkluzní kritéria:

      Přítomnost nestabilních kostních metastáz nebo rozsáhlého postižení kostí spojeného s vysokým rizikem zlomeniny.

      Nekontrolovaná kardiovaskulární, respirační, muskuloskeletální nebo metabolická onemocnění, která kontraindikují fyzickou aktivitu podle uvážení vyšetřovatele.

      Explicitní lékařská kontraindikace k cvičebnímu tréninku. Dokumentovaná špatná adherence (<80 %). Ukončení léčby, progrese onemocnění, intolerance nebo jakákoli jiná lékařská, osobní nebo logistická okolnost, která by podle názoru vyšetřovatelů mohla ohrozit bezpečnost účastníka nebo integritu studie.

      Velikost vzorku Pro vyhodnocení velikosti vzorku studie byl zvolen dvoufaktorový ANOVA design s mezijednotkovým faktorem (kontrolní a intervenční skupiny) a vnitrojednotkovým faktorem (před-po a šestiměsíční sledování). Požadovaná celková velikost vzorku by byla 42, uvažujeme-li velikost účinku f=0,20, hladinu významnosti 5 %, sílu 80 % a korelaci mezi opakovanými měřeními 0,5. Odhaduje se, že může dojít ke ztrátě 20 % na sledování mezi dvěma experimentálními skupinami, a proto je celková velikost vzorku 50 jedinců na kohortu.

      Metodologie Biologické vzorky studie Vzorky periferní krve (jedna 10 ml EDTA zkumavka) budou odebrány ve třech časových bodech: 1) před zahájením programu; 2) po 12 týdnech intervence; 3) 6měsíční sledování. Izolované mononukleární buňky periferní krve (PBMC), sérum a plazma budou řádně uchovány v biobance IBSAL za standardizovaných podmínek.

      Proteomická charakterizace Kvantitativní proteomická analýza plazmy pomocí technologie PreOmics® ENRICHplus, následovaná kapalinovou chromatografií spojenou s iontovou pohyblivostní spektrometrií (LC-IMS/MS), která umožní reprodukovatelnou a vysoce citlivou analýzu z minimálního objemu plazmy (50 µL).

      Kvantitativní proteomická analýza eluovaných peptidů bude provedena na systému LC Evosep One (Evosep Biosystems, Dánsko), připojeném k MS timsTOF Pro 2 (Bruker Corporation, USA), s použitím separační metody 60 vzorků/den. Bude aplikován přístup DIA-PASEF s rozsahem hmotnosti/náboje 100 až 1700 a rozsahem iontové pohyblivosti 0,85-1,30 1/K0, s cyklovým časem 100 ms.

      Imunofenotypizace Pro analýzy imunitních populací (cíl 1) budou vyšetřovatelé používat panel zahrnující protilátky proti CD45, CD3, CD4, CD8, CD5, CD7, TCR, CD27, CD45RA, CD127, CD25RA, CD56, HLA-DR, CD11c, CD123, CD33, CD14 a CD16 s minimální akvizicí 500 000 událostí. Tento panel umožní identifikaci různých subpopulací T lymfocytů, NK buněk, dendritických buněk a monocytů. Pro analýzu B buněk použijeme strategii screeningu LST, jak je popsáno společností EuroFlow. Všechny analýzy budou provedeny pomocí 8barevného cytometru FACScanto a softwaru Infinicyt. Všechny vzorky budou zpracovány na Všeobecné službě průtokové cytometrie Univerzity v Salamance (www.nucleus.usal.es) a na Oddělení hematologie.

      Metabolomické profilování Plazmatické proteiny budou vysráženy metanolem a glycerofosfolipidy extrahovány pomocí SPE. Po filtraci bude každý roztok upraven na 600 µL s D₂O a převeden do 5 mm NMR trubiček. NMR analýzy budou provedeny při 298 K na spektrometru Bruker Avance Neo 400 MHz s kryosondou. Parametry budou optimalizovány pro kvantifikaci metabolitů pomocí Chenomx NMR Suite 10 (Chenomx, Edmonton, Kanada). Identifikace a kvantifikace metabolitů bude provedena s tímto softwarem, který umožňuje spolehlivou dekonvoluci a stanovení koncentrací ve složitých spektrech. Přiřazení protonových píků bude dále validováno porovnáním chemických posunů s Human Metabolome Database (http://www.hmdb.ca).

      Transkriptomická a genomická analýza Izolace cfRNA a DNA Izolace plazmatické cfRNA bude provedena pomocí sady miRNeasy Serum/Plasma Advanced Kit (Qiagen), optimalizované pro nízký výtěžek a krátké fragmenty RNA. Koncentrace a čistota RNA budou stanoveny fluorometricky pomocí testu Qubit RNA HS Assay (Invitrogen). Plazmatická ctDNA bude extrahována pomocí sady QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit (Qiagen, Hilden, Německo). Genomická DNA (gDNA) bude izolována z periferní krve pomocí sady QIAamp DNA Blood Midi Kit (Qiagen, Německo) podle standardních protokolů.

      Příprava knihoven a sekvenování Knihovny cfRNA budou generovány pomocí sady Qiagen QIAseq cfRNA All-in-One Kit, optimalizované pro nízký vstup RNA a krátké fragmenty. Sekvenování bude provedeno na sekvenátoru NovaSeq X (Illumina, San Diego, CA, USA), produkujícím párové čtení 150 bp (2×150 bp) s průměrnou hloubkou větší než 50 milionů čtení, aby se maximalizovala detekce transkriptů s nízkou abundancí.

      Příprava knihoven a sekvenování ctDNA a gDNA bude provedena pomocí sady pro zachycení SureSelect V6 (Agilent, Santa Clara, CA, USA) a technologie Illumina (NovaSeq 6000, 150PE 2×150 bp), dosahující průměrné sekvenační hloubky 18 Gb/vzorek.

      Bioinformatická analýza Kvalita FASTQ souborů získaných ze sekvenování bude hodnocena pomocí FastQC (Quality Control Tool for High Throughput Sequence Data). Surová čtení podstoupí kontrolu kvality s FastQC a MultiQC, následovanou ořezáváním adaptérů a odstraněním nízkokvalitních čtení pomocí Trimmomatic. Zarovnání na lidský referenční genom (GRCh38) bude provedeno pomocí STAR (v2.7) a hojnost genů bude kvantifikována pomocí featureCounts (balíček Subread). Normalizace a analýza diferenciální exprese budou provedeny pomocí DESeq2 (Bioconductor), s použitím upravených p-hodnot <0,05 jako prahu významnosti. Funkční a drahové obohacovací analýzy budou provedeny s clusterProfiler, GOplot a GSEA. Diferenciálně exprimované geny budou validovány reverzní transkripcí a kvantitativní PCR v reálném čase.

      Genomická analýza Párová čtení budou zarovnána na lidský genom (GRCh37) pomocí BWA-MEM (v0.7.17). Výsledné SAM soubory budou zpracovány pro zlepšení efektivity následných analýz, včetně odstranění duplikátů pomocí MarkDuplicatesSpark (GATK). Rekalibrace skóre kvality bází bude provedena s BaseRecalibrator a ApplyBQSR (GATK). Volání somatických variant bude provedeno s Mutect2 (GATK, párový režim), následované filtrováním pomocí FilterMutectCalls. Germline varianty (SNV a INDELY) budou identifikovány pomocí HaplotypeCaller a filtrovány pomocí tvrdých filtrů. Vybrané varianty budou anotovány pomocí Funcotator a patogenita variant bude hodnocena pomocí Varank (v1.4.3). Frekvence a distribuce detekovaných SNV a INDELů budou porovnány s databázemi zdravých dárců (NHLBI-ESP a gnomAD) pomocí ANNOVAR.

      Integrace multi-omics Omics data budou integrována pomocí pipeline vyvinutých Bioinformatickou jednotkou IBSAL. Nástroje strojového učení (Random Forest, SVM) a síťová analýza (Weighted Gene Co-expression Network Analysis, WGCNA) budou aplikovány k identifikaci společných a specifických molekulárních vzorců pro typ nádoru. Multi-OMics-Factor Analysis (MOFA). Integrace multi-omics a klinických dat umožní vývoj prediktivních modelů odpovědi na fyzickou aktivitu.

      Klinická, funkční a psychologická hodnocení Všechny klinické a funkční výsledky budou shromažďovány ve třech časových bodech: 1) před zahájením programu, 2) po 12 týdnech intervence, 3) 6měsíční sledování.

      Ve všech případech budou všichni jedinci hodnoceni: Svalová síla (dynamometrie), složení těla (Tanita BC-418), funkční stav (Short Physical Performance Battery), kvalita života (EORTC QLQ-C30), psychická pohoda (Hospital anxiety and depression scale), kvalita spánku (Athens Insomnia scale), úroveň fyzické aktivity (International Physical Activity Questionnaire).

      Intervence Intervence obou skupin (program silového tréninku a domácí cvičební program) je detailně popsána v publikovaných studijních protokolech.