Präzisions-Körperliche Übung für Personalisierte Onko-Hämatologie. (PEPOH)

Das Hauptziel des PEPOH-Projekts ist die Charakterisierung und Vorhersage des klinischen Ansprechens auf Krafttraining bei soliden und/oder hämatologischen Tumoren bei Patienten (unter aktiver Therapie und/oder während des Therapieprozesses) durch eine umfassende und systematische Integration von Multi-Omics-Datensätzen, um Signaturen zu bestimmen, die mit der Behandlungstoleranz, dem Krankheitsfortschritt und dem Gesamtüberleben assoziiert sind.

Aus diesem Hauptziel ergeben sich mehrere spezifische Ziele:

1. - Bestimmung des immunmodulatorischen Effekts von körperlicher Bewegung durch Entschlüsselung differenzieller molekularer Profile im peripheren Blut durch Next-Generation-Sequenzierung (RNA, SNPs, CHIP), Proteomik und Metabolomik, die neue Einblicke für eine umfassende Analyse der Auswirkungen von Bewegung auf Patienten bieten.

2. - Bewertung der Auswirkungen eines körperlichen Trainingsprogramms bei onkohämatologischen Patienten auf mehrdimensionale Indikatoren ihrer intrinsischen Kapazität in Bezug auf die allgemeine Lebensqualität:

   1. - Funktionelle körperliche Verfassung (Muskelkraft, Gehgeschwindigkeit, Gleichgewicht und Müdigkeit).
   2. - Psychisches Wohlbefinden und psychische Gesundheit.
   3. - Körperzusammensetzung und anthropometrische Variablen.

   4. - Schlafqualität, allgemeine Lebensqualität und krebsbezogene Lebensqualität.

      All diese Ziele entsprechen drei Hauptprioritäten in der aktuellen Onkologie:

      1. Verständnis der physiologischen und molekularen Mechanismen, die den therapeutischen Effekten von Bewegung zugrunde liegen.
      2. Generierung robuster Evidenz in hoch vulnerablen und unterrepräsentierten Bevölkerungsgruppen, wie Patienten mit hämatologischen Krebserkrankungen.
      3. Schaffung der Grundlage für die Integration von Krafttraining als standardisierte adjuvante Intervention innerhalb des klinischen Managements von Krebs.

      Der Mehrwert von PEPOH liegt in seinem translationalen und multidisziplinären Ansatz, der Grundlagenwissenschaft mit klinischer Praxis, Molekularbiologie mit Bewegungsphysiologie und Multi-Omics-Analyse mit umfassender Patientenbewertung kombiniert. Durch diesen Rahmen zielt das Projekt darauf ab, zu einem Paradigmenwechsel in der onkologischen Versorgung beizutragen, indem körperliche Bewegung als personalisiertes therapeutisches Werkzeug integriert wird, das Überleben, Wohlbefinden und Lebensqualität bei Menschen mit Krebs verbessern kann.

      Unter Berücksichtigung des multidisziplinären Aspekts des PEPOH-Projekts wird der molekulare Fingerabdruck -erhalten durch Multi-Omics-Charakterisierung- von onkohämatologischen Patienten unter Krafttraining ein Vorteil sein, um die biologische Grundlage seiner therapeutischen Anwendung bereitzustellen, da er mit Behandlungstoleranz und Überleben zusammenhängt. Zusätzlich könnten diese molekularen Signaturen neue biologische Einblicke in die Regulation von Entzündungen, Energiestoffwechsel, Tumorimmunität, Muskelplastizität, Alterung und Gebrechlichkeit bieten. Alle diese Erkenntnisse werden es den Forschern ermöglichen, Mechanismen zu entschlüsseln, die die funktionelle und emotionale Verbesserung nach Bewegung erklären.

      Darüber hinaus wird die tiefgreifende Multi-Omics-Charakterisierung einer gut charakterisierten und definierten Patientenkohorte neue Datensätze liefern, die für weitere biomedizinische Studien äußerst nützlich sein und eine Referenz für die wissenschaftliche Gemeinschaft darstellen könnten.

      Aus klinischer Sicht wird die systematische und genaue Integration molekularer und klinischer Datensätze die Entwicklung prädiktiver Ansprechmodelle ermöglichen, die helfen, die Wirksamkeit von Bewegungsinterventionen für jeden Patienten und Tumor zu bewerten, genannt Präzisionsbewegung.

      Zusammenfassend wird das PEPOH-Projekt translationale Evidenz liefern, um die Integration von Bewegung als personalisierte und kosteneffektive adjuvante Intervention innerhalb des umfassenden Ansatzes für Patienten mit Krebs zu unterstützen und so zur Entwicklung der Präzisionsonkologie beizutragen.

      Studiendesign PEPOH ist eine randomisierte, kontrollierte klinische Studie. Die Studie wird am Universitätsklinikum Salamanca durchgeführt, mit der technischen und wissenschaftlichen Unterstützung von FIBSAL.

      Population

      Die Studie umfasst fünf Patienten-Kohorten, die den folgenden Diagnosen entsprechen: Lungenkrebs, Darmkrebs, Brustkrebs, chronische lymphatische Leukämie und multiples Myelom. Jede Kohorte besteht aus 50 Patienten, was einer Gesamtstichprobe von 250 Patienten entspricht. Nach einer Basisbewertung werden die Patienten randomisiert (1:1) einer von zwei Studiengruppen zugeteilt:

      Supervidierte Interventionsgruppe: Ein Krafttrainingsprogramm, das zweimal pro Woche über 12 Wochen unter professioneller Aufsicht durchgeführt wird, ergänzt durch ein Heimtrainingsprogramm.

      Kontrollgruppe: Ein Heimtrainingsprogramm, das den gleichen Empfehlungen und Richtlinien wie die supervidierte Gruppe folgt, jedoch ohne supervidierte persönliche Sitzungen.

      Bewertungen werden zu Beginn und nach der 12-wöchigen Intervention durchgeführt, mit einer zusätzlichen Nachuntersuchung nach 6 Monaten, um die Persistenz klinischer und molekularer Effekte mittelfristig zu analysieren.

      Einschlusskriterien:

      • Erwachsene Patienten (≥18 Jahre), in der Lage, die Einwilligungserklärung zu unterschreiben und bereit, an der Studie teilzunehmen.
      • Leistungsstatus (ECOG) 0-2.

      Spezifische Einschlusskriterien sind für jede an der Studie beteiligte Kohorte wie folgt definiert:

      Lungenkrebs: Patienten mit diagnostiziertem nicht-kleinzelligem Lungenkarzinom im metastasierten Stadium, geeignet für kombinierte Immuntherapie und Chemotherapie, mit aktiver Behandlung.

      Darmkrebs: Patienten mit reseziertem Darmkrebs im Stadium II, III oder IV, die sich einer adjuvanten Chemotherapie unterziehen.

      Brustkrebs: Weibliche Patienten mit histologisch bestätigtem hormonrezeptorpositivem/HER2-negativem Brustkrebs, die aktive Hormontherapie (Tamoxifen, Aromatasehemmer oder Fulvestrant) entweder in adjuvanter oder stabiler metastasierter Phase erhalten.

      Chronische lymphatische Leukämie (CLL): Patienten mit diagnostizierter CLL, die keine pharmakologische Behandlung erhalten haben und nicht benötigen.

      Multiples Myelom (MM): Patienten mit bestätigter neuer MM-Diagnose unter aktiver Erstlinientherapie und nicht für eine autologe Transplantation geeignet.

      Ausschlusskriterien:

      Vorhandensein instabiler Knochenmetastasen oder ausgedehnter Knochenbeteiligung, die mit einem hohen Frakturrisiko verbunden sind.

      Unkontrollierte kardiovaskuläre, respiratorische, muskuloskelettale oder metabolische Erkrankungen, die körperliche Bewegung nach Ermessen des Prüfers kontraindizieren.

      Explizite medizinische Kontraindikation für Bewegungstraining. Dokumentierte schlechte Adhärenz (<80%). Behandlungsabbruch, Krankheitsfortschritt, Unverträglichkeit oder jegliche andere medizinische, persönliche oder logistische Umstände, die nach Meinung der Prüfer die Sicherheit der Teilnehmer oder die Integrität der Studie beeinträchtigen könnten.

      Stichprobengröße Ein zweifaktorielles ANOVA-Design mit einem zwischenindividuellen Faktor (Kontroll- und Interventionsgruppen) und einem innerhalbindividuellen Faktor (Vorher-Nachher und Sechs-Monats-Nachuntersuchung) wurde gewählt, um die Stichprobengröße der Studie zu bewerten. Die erforderliche Gesamtstichprobengröße beträgt 42, unter Berücksichtigung einer Effektgröße von f=0,20, einem Signifikanzniveau von 5%, einer Power von 80% und einer Korrelation zwischen wiederholten Messungen von 0,5. Es wird geschätzt, dass es einen Verlust von 20% in der Nachuntersuchung zwischen den beiden experimentellen Gruppen geben könnte, und daher beträgt die Gesamtstichprobengröße 50 Personen pro Kohorte.

      Methodik Biologische Proben der Studie Periphere Blutproben (ein 10-ml-EDTA-Röhrchen) werden zu drei Zeitpunkten entnommen: 1) vor Beginn des Programms; 2) nach 12 Wochen Intervention; 3) 6-Monats-Nachuntersuchung. Isolierte periphere mononukleäre Blutzellen (PBMCs), Serum und Plasma, die ordnungsgemäß unter standardisierten Bedingungen in der IBSAL-Biobank aufbewahrt werden.

      Proteomik-Charakterisierung Quantitative proteomische Analyse von Plasma durch PreOmics® ENRICHplus-Technologie, gefolgt von Flüssigkeitschromatographie gekoppelt mit Ionenmobilitätsspektrometrie (LC-IMS/MS), die eine reproduzierbare und hochsensitive Analyse aus einem minimalen Plasmavolumen (50µL) ermöglicht.

      Die quantitative proteomische Analyse der eluierten Peptide wird an einem LC Evosep One-System (Evosep Biosystems, Dänemark) durchgeführt, gekoppelt an ein MS timsTOF Pro 2 (Bruker Corporation, USA), unter Verwendung einer Trennmethode von 60 Proben/Tag. Ein DIA-PASEF-Ansatz wird mit einem Masse/Ladungs-Bereich von 100 bis 1700 und einem Ionenmobilitätsbereich von 0,85-1,30 1/K0, mit einer Zykluszeit von 100 ms angewendet.

      Immunphänotypisierung Für Immunpopulationenanalysen (Ziel 1) werden die Prüfer ein Panel verwenden, das Antikörper gegen CD45, CD3, CD4, CD8, CD5, CD7, TCR, CD27, CD45RA, CD127, CD25RA, CD56, HLA-DR, CD11c, CD123, CD33, CD14 und CD16 mit einer minimalen Akquisition von 500.000 Ereignissen umfasst. Dieses Panel ermöglicht die Identifizierung verschiedener Subpopulationen von T-Lymphozyten, NK-Zellen, dendritischen Zellen und Monozyten. Für die B-Zell-Analyse werden wir die LST-Screening-Strategie wie von EuroFlow beschrieben anwenden. Alle Analysen werden unter Verwendung eines 8-Farben-FACScanto-Zytometers und der Infinicyt-Software durchgeführt. Alle Proben werden am Allgemeinen Durchflusszytometrie-Service der Universität Salamanca (www.nucleus.usal.es) und in der Abteilung für Hämatologie verarbeitet.

      Metabolomik-Profiling Plasmoproteine werden mit Methanol ausgefällt und Glycerophospholipide durch SPE extrahiert. Nach Filtration wird jede Lösung mit D₂O auf 600 µL eingestellt und in 5-mm-NMR-Röhrchen überführt. NMR-Analysen werden bei 298 K an einem Bruker Avance Neo 400 MHz Spektrometer mit einer Kryosonde durchgeführt. Parameter werden für die Metabolitenquantifizierung unter Verwendung von Chenomx NMR Suite 10 (Chenomx, Edmonton, Kanada) optimiert. Metabolitenidentifikation und -quantifizierung werden mit dieser Software durchgeführt, die eine zuverlässige Dekonvolution und Konzentrationsbestimmung in komplexen Spektren ermöglicht. Protonenpeak-Zuordnungen werden weiter durch Vergleich chemischer Verschiebungen mit der Human Metabolome Database (http://www.hmdb.ca) validiert.

      Transkriptomische und genomische Analyse cfRNA- und DNA-Extraktion Die Plasma-cfRNA-Extraktion wird unter Verwendung des miRNeasy Serum/Plasma Advanced Kit (Qiagen) durchgeführt, optimiert für niedrige Ausbeute und kurze RNA-Fragmente. Die RNA-Konzentration und -Reinheit wird fluorometrisch unter Verwendung des Qubit RNA HS Assay (Invitrogen) bestimmt.Plasma-ctDNA wird unter Verwendung des QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit (Qiagen, Hilden, Deutschland) extrahiert. Genomische DNA (gDNA) wird aus peripherem Blut unter Verwendung des QIAamp DNA Blood Midi Kit (Qiagen, Deutschland) gemäß Standardprotokollen isoliert.

      Bibliotheksvorbereitung und Sequenzierung cfRNA-Bibliotheken werden unter Verwendung des Qiagen QIAseq cfRNA All-in-One Kit generiert, optimiert für niedrige RNA-Eingabe und kurze Fragmente. Die Sequenzierung wird an einem NovaSeq X-Sequenzer (Illumina, San Diego, CA, USA) durchgeführt, der 150-bp gepaarte End-Lesevorgänge (2×150 bp) mit einer durchschnittlichen Tiefe von mehr als 50 Millionen Reads produziert, um die Detektion niedrig exprimierter Transkripte zu maximieren.

      ctDNA- und gDNA-Bibliotheksvorbereitung und -sequenzierung werden unter Verwendung des SureSelect V6 Capture Kit (Agilent, Santa Clara, CA, USA) und Illumina-Technologie (NovaSeq 6000, 150PE 2×150 bp) durchgeführt, wobei eine durchschnittliche Sequenzierungstiefe von 18 Gb/Probe erreicht wird.

      Bioinformatische Analyse Die Qualität der aus der Sequenzierung erhaltenen FASTQ-Dateien wird mit FastQC (Quality Control Tool for High Throughput Sequence Data) bewertet. Roh-Reads werden einer Qualitätskontrolle mit FastQC und MultiQC unterzogen, gefolgt von Adapter-Trimming und Entfernung von Reads niedriger Qualität unter Verwendung von Trimmomatic. Die Ausrichtung an das menschliche Referenzgenom (GRCh38) wird mit STAR (v2.7) durchgeführt und die Genhäufigkeit mit featureCounts (Subread-Paket) quantifiziert. Normalisierung und differentielle Expressionsanalyse werden unter Verwendung von DESeq2 (Bioconductor) durchgeführt, wobei adjustierte p-Werte <0,05 als Signifikanzschwelle angewendet werden. Funktionelle und Pathway-Anreicherungsanalysen werden mit clusterProfiler, GOplot und GSEA durchgeführt. Differenziell exprimierte Gene werden durch Reverse Transkription und quantitative Echtzeit-PCR validiert.

      Genomische Analyse Gepaarte End-Reads werden unter Verwendung von BWA-MEM (v0.7.17) an das menschliche Genom (GRCh37) ausgerichtet. Die resultierenden SAM-Dateien werden verarbeitet, um die Effizienz nachgelagerter Analysen zu verbessern, einschließlich Duplikatentfernung unter Verwendung von MarkDuplicatesSpark (GATK). Die Basisqualitätsscore-Rekalibrierung wird mit BaseRecalibrator und ApplyBQSR (GATK) durchgeführt. Somatische Variantenidentifizierung wird mit Mutect2 (GATK, gepaarter Modus) durchgeführt, gefolgt von Filterung unter Verwendung von FilterMutectCalls. Keimbahnvarianten (SNVs und INDELs) werden mit HaplotypeCaller identifiziert und mit harten Filtern gefiltert. Ausgewählte Varianten werden mit Funcotator annotiert und die Variantenpathogenität mit Varank (v1.4.3) bewertet. Die Häufigkeit und Verteilung detektierter SNVs und INDELs wird gegen gesunde Spenderdatenbanken (NHLBI-ESP und gnomAD) unter Verwendung von ANNOVAR verglichen.

      Multi-Omics-Integration Omics-Daten werden unter Verwendung von Pipelines integriert, die von der Bioinformatik-Einheit von IBSAL entwickelt wurden. Maschinelle Lernwerkzeuge (Random Forest, SVM) und Netzwerkanalyse (Weighted Gene Co-expression Network Analysis, WGCNA) werden angewendet, um gemeinsame und tumorspezifische molekulare Muster zu identifizieren. Multi-OMics-Factor Analysis (MOFA). Die Integration von Multi-Omics- und klinischen Daten wird die Entwicklung prädiktiver Modelle des Ansprechens auf körperliche Bewegung ermöglichen.

      Klinische, funktionelle und psychologische Bewertungen Alle klinischen und funktionellen Ergebnisse werden zu drei Zeitpunkten erhoben: 1) vor Beginn des Programms, 2) nach 12 Wochen Intervention, 3) 6-Monats-Nachuntersuchung.

      In allen Fällen werden alle Individuen bewertet: Muskelkraft (Dynamometrie), Körperzusammensetzung (Tanita BC-418), funktioneller Status (Short Physical Performance Battery), Lebensqualität (EORTC QLQ-C30), psychisches Wohlbefinden (Hospital Anxiety and Depression Scale), Schlafqualität (Athens Insomnia Scale), körperliche Aktivitätsniveau (International Physical Activity Questionnaire).

      Intervention Die Intervention beider Gruppen (Krafttrainingsprogramm und Heimtrainingsprogramm) ist in den veröffentlichten Studienprotokollen detailliert beschrieben.