Ejercicio Físico de Precisión para Onco-Hematología Personalizada. (PEPOH)

El objetivo principal del proyecto PEPOH es caracterizar y predecir la respuesta clínica al entrenamiento de fuerza en tumores sólidos y/o hematológicos en pacientes (bajo terapia activa y/o durante el proceso terapéutico) mediante una integración exhaustiva y sistemática de conjuntos de datos multi-ómicos para determinar firmas asociadas con la tolerancia al tratamiento, la progresión de la enfermedad y la supervivencia global.

De este objetivo principal se derivan varios objetivos específicos:

1. - Determinar el efecto inmunomodulador del ejercicio físico descifrando perfiles moleculares diferenciales en sangre periférica mediante secuenciación de nueva generación (ARN, SNPs, CHIP), proteómica y metabolómica, lo que proporciona nuevas perspectivas para un análisis integral del efecto del ejercicio en los pacientes.

2. - Evaluar el impacto de un programa de ejercicio físico en pacientes oncohematológicos sobre indicadores multidimensionales de su capacidad intrínseca relacionados con la calidad de vida global:

   1. - Condición física funcional (fuerza muscular, velocidad al caminar, equilibrio y fatiga).
   2. - Bienestar psicológico y salud mental.
   3. - Composición corporal y variables antropométricas.

   4. - Calidad del sueño, calidad de vida global y calidad de vida relacionada con el cáncer.

      Todos estos objetivos responden a tres prioridades principales en la oncología actual:

      1. Comprender los mecanismos fisiológicos y moleculares subyacentes a los efectos terapéuticos del ejercicio.
      2. Generar evidencia sólida en poblaciones altamente vulnerables y poco representadas, como los pacientes con cáncer hematológico.
      3. Establecer las bases para incorporar el entrenamiento de fuerza como una intervención adyuvante estandarizada dentro del manejo clínico del cáncer.

      El valor añadido de PEPOH radica en su enfoque traslacional y multidisciplinar, que combina ciencia básica con práctica clínica, biología molecular con fisiología del ejercicio, y análisis multi-ómico con evaluación integral del paciente. A través de este marco, el proyecto pretende contribuir a un cambio de paradigma en la atención oncológica integrando el ejercicio físico como una herramienta terapéutica personalizada capaz de mejorar la supervivencia, el bienestar y la calidad de vida en personas con cáncer.

      Teniendo en cuenta el aspecto multidisciplinar del proyecto PEPOH, la huella molecular -obtenida mediante caracterización multi-ómica- de pacientes oncohematológicos bajo entrenamiento de fuerza será un activo para proporcionar la base biológica de su uso terapéutico, ya que está relacionada con la tolerancia al tratamiento y la supervivencia. Además, estas firmas moleculares podrían proporcionar nuevas perspectivas biológicas en la regulación de la inflamación, el metabolismo energético, la inmunidad tumoral, la plasticidad muscular, el envejecimiento y la fragilidad. Todos estos hallazgos permitirán a los investigadores descifrar mecanismos que expliquen la mejora funcional y emocional observada después del ejercicio.

      Además, la profunda caracterización multi-ómica de una cohorte de pacientes bien caracterizada y definida proporcionará nuevos conjuntos de datos, que podrían ser muy útiles para futuros estudios biomédicos y una referencia para la comunidad científica.

      Desde un punto de vista clínico, la integración sistemática y precisa de conjuntos de datos moleculares y clínicos permitirá el desarrollo de modelos predictivos de respuesta que ayuden a evaluar la eficacia de las intervenciones de ejercicio para cada paciente y tumor, denominado ejercicio de precisión.

      En resumen, el proyecto PEPOH proporcionará evidencia traslacional para respaldar la incorporación del ejercicio como una intervención adyuvante personalizada y rentable dentro del enfoque integral de los pacientes con cáncer, contribuyendo al desarrollo de la oncología de precisión.

      Diseño del estudio PEPOH es un ensayo clínico aleatorizado y controlado. El estudio se llevará a cabo en el Hospital Universitario de Salamanca, con el apoyo técnico y científico de FIBSAL.

      Población

      El ensayo incluirá cinco cohortes de pacientes correspondientes a los siguientes diagnósticos: cáncer de pulmón, cáncer colorrectal, cáncer de mama, leucemia linfocítica crónica y mieloma múltiple. Cada cohorte constará de 50 pacientes, resultando en una muestra total de 250 pacientes. Después de una evaluación basal, los pacientes serán asignados aleatoriamente (1:1) a uno de los dos grupos de estudio:

      Grupo de intervención supervisada: un programa de entrenamiento de fuerza realizado dos veces por semana durante 12 semanas bajo supervisión profesional, complementado con un programa de ejercicio domiciliario.

      Grupo control: un programa de ejercicio domiciliario siguiendo las mismas recomendaciones y pautas que el grupo supervisado pero sin sesiones presenciales supervisadas.

      Las evaluaciones se realizarán al inicio y después de la intervención de 12 semanas, con un seguimiento adicional a los 6 meses para analizar la persistencia de los efectos clínicos y moleculares a medio plazo.

      Criterios de inclusión:

      • Pacientes adultos (≥18 años), capaces de firmar el consentimiento informado y dispuestos a participar en el estudio.
      • Estado funcional (ECOG) 0-2.

      Los criterios de inclusión específicos se definen para cada cohorte involucrada en el estudio de la siguiente manera:

      Cáncer de pulmón: Pacientes diagnosticados con carcinoma de pulmón no microcítico en estadio metastásico, elegibles para inmunoterapia combinada y quimioterapia, con tratamiento activo.

      Cáncer colorrectal: Pacientes con cáncer colorrectal resecado en estadio II, III o IV sometidos a quimioterapia adyuvante.

      Cáncer de mama: Pacientes de sexo femenino con cáncer de mama histológicamente confirmado receptor hormonal positivo/HER2 negativo, recibiendo terapia hormonal activa (tamoxifeno, inhibidor de aromatasa o fulvestrant) ya sea en fase adyuvante o metastásica estable.

      Leucemia linfocítica crónica (LLC): Pacientes diagnosticados con LLC que no han recibido y no necesitan tratamiento farmacológico.

      Mieloma múltiple (MM): Pacientes con un nuevo diagnóstico confirmado de MM bajo tratamiento activo de primera línea y no candidatos a trasplante autólogo.

      Criterios de exclusión:

      Presencia de metástasis óseas inestables o afectación ósea extensa asociada con alto riesgo de fractura.

      Enfermedades cardiovasculares, respiratorias, musculoesqueléticas o metabólicas no controladas que contraindiquen el ejercicio físico a criterio del investigador.

      Contraindicación médica explícita para el entrenamiento físico. Adherencia documentada deficiente (<80%). Interrupción del tratamiento, progresión de la enfermedad, intolerancia o cualquier otra circunstancia médica, personal o logística que, en opinión de los investigadores, pueda comprometer la seguridad del participante o la integridad del estudio.

      Tamaño de la muestra Se eligió un diseño ANOVA de dos factores con un factor entre individuos (grupos control e intervención) y un factor dentro de individuos (pre-post y seguimiento a seis meses) para evaluar el tamaño de la muestra del estudio. El tamaño de muestra total requerido sería de 42, considerando un tamaño del efecto de f=0.20, un nivel de significación del 5%, una potencia del 80% y una correlación entre medidas repetidas de 0.5. Se estima que puede haber una pérdida del 20% en el seguimiento entre los dos grupos experimentales, y por lo tanto el tamaño de muestra total es de 50 individuos por cohorte.

      Metodología Muestras biológicas del estudio Se recolectarán muestras de sangre periférica (un tubo de 10 mL con EDTA) en tres momentos: 1) antes de comenzar el programa; 2) después de 12 semanas de intervención; 3) seguimiento a 6 meses. Células mononucleares de sangre periférica aisladas (PBMCs), suero y plasma, que se conservarán adecuadamente en el biobanco del IBSAL bajo condiciones estandarizadas.

      Caracterización Proteómica Análisis proteómico cuantitativo de plasma mediante tecnología PreOmics® ENRICHplus, seguido de cromatografía líquida acoplada a espectrometría de movilidad iónica (LC-IMS/MS), lo que permitirá un análisis reproducible y altamente sensible a partir de un volumen mínimo de plasma (50µL).

      El análisis proteómico cuantitativo de los péptidos eluidos se realizará en un sistema LC Evosep One (Evosep Biosystems, Dinamarca), acoplado a un MS timsTOF Pro 2 (Bruker Corporation, EE. UU.), utilizando un método de separación de 60 muestras/día. Se aplicará un enfoque DIA-PASEF con un rango de masa/carga de 100 a 1700 y un rango de movilidad iónica de 0.85-1.30 1/K0, con un tiempo de ciclo de 100ms.

      Inmunofenotipado Para los análisis de poblaciones inmunes (objetivo 1), los investigadores utilizarán un panel que incluye anticuerpos contra CD45, CD3, CD4, CD8, CD5, CD7, TCR, CD27, CD45RA, CD127, CD25RA, CD56, HLA-DR, CD11c, CD123, CD33, CD14 y CD16 con una adquisición mínima de 500.000 eventos. Este panel permitirá la identificación de diferentes subpoblaciones de linfocitos T, células NK, células dendríticas y monocitos. Para el análisis de células B, emplearemos la estrategia de cribado LST como se describe por EuroFlow. Todos los análisis se realizarán utilizando un citómetro FACScanto de 8 colores y el software Infinicyt. Todas las muestras se procesarán en el Servicio General de Citometría de Flujo de la Universidad de Salamanca (www.nucleus.usal.es) y en el Departamento de Hematología.

      Perfilado Metabolómico Las proteínas plasmáticas se precipitarán con metanol, y los glicerofosfolípidos se extraerán por SPE. Después de la filtración, cada solución se ajustará a 600 µL con D₂O y se transferirá a tubos de RMN de 5 mm. Los análisis de RMN se realizarán a 298 K en un espectrómetro Bruker Avance Neo 400 MHz con una criosonda. Los parámetros se optimizarán para la cuantificación de metabolitos utilizando Chenomx NMR Suite 10 (Chenomx, Edmonton, Canadá). La identificación y cuantificación de metabolitos se llevará a cabo con este software, que permite una deconvolución fiable y la determinación de concentraciones en espectros complejos. Las asignaciones de picos de protón se validarán además comparando los desplazamientos químicos con la Base de Datos del Metaboloma Humano (http://www.hmdb.ca).

      Análisis Transcriptómico y Genómico Extracción de cfARN y ADN La extracción de cfARN plasmático se realizará utilizando el kit miRNeasy Serum/Plasma Advanced (Qiagen), optimizado para fragmentos de ARN de bajo rendimiento y cortos. La concentración y pureza del ARN se determinarán fluorométricamente utilizando el ensayo Qubit RNA HS (Invitrogen).El ctDNA plasmático se extraerá utilizando el kit QIAamp Circulating Nucleic Acid (Qiagen, Hilden, Alemania). El ADN genómico (gDNA) se aislará de sangre periférica utilizando el kit QIAamp DNA Blood Midi (Qiagen, Alemania) siguiendo protocolos estándar.

      Preparación de Bibliotecas y Secuenciación Las bibliotecas de cfARN se generarán utilizando el kit Qiagen QIAseq cfRNA All-in-One, optimizado para baja cantidad de ARN y fragmentos cortos. La secuenciación se realizará en un secuenciador NovaSeq X (Illumina, San Diego, CA, EE. UU.), produciendo lecturas pareadas de 150pb (2×150pb) con una profundidad promedio mayor de 50 millones de lecturas para maximizar la detección de transcritos de baja abundancia.

      La preparación y secuenciación de bibliotecas de ctDNA y gDNA se realizará utilizando el kit de captura SureSelect V6 (Agilent, Santa Clara, CA, EE. UU.) y tecnología Illumina (NovaSeq 6000, 150PE 2×150pb), alcanzando una profundidad de secuenciación promedio de 18Gb/muestra.

      Análisis Bioinformático La calidad de los archivos FASTQ obtenidos de la secuenciación se evaluará con FastQC (Herramienta de Control de Calidad para Datos de Secuenciación de Alto Rendimiento). Las lecturas crudas se someterán a control de calidad con FastQC y MultiQC, seguido de recorte de adaptadores y eliminación de lecturas de baja calidad utilizando Trimmomatic. La alineación al genoma de referencia humano (GRCh38) se realizará con STAR (v2.7), y la abundancia génica se cuantificará utilizando featureCounts (paquete Subread). El análisis de normalización y expresión diferencial se llevará a cabo utilizando DESeq2 (Bioconductor), aplicando valores p ajustados <0.05 como umbral de significación. Los análisis de enriquecimiento funcional y de rutas se realizarán con clusterProfiler, GOplot y GSEA. Los genes expresados diferencialmente se validarán mediante transcripción inversa y PCR cuantitativa en tiempo real.

      Análisis Genómico Las lecturas pareadas se alinearán al genoma humano (GRCh37) utilizando BWA-MEM (v0.7.17). Los archivos SAM resultantes se procesarán para mejorar la eficiencia de los análisis posteriores, incluida la eliminación de duplicados utilizando MarkDuplicatesSpark (GATK). La recalibración de la puntuación de calidad de bases se realizará con BaseRecalibrator y ApplyBQSR (GATK). La llamada de variantes somáticas se realizará con Mutect2 (GATK, modo pareado), seguida de filtrado utilizando FilterMutectCalls. Las variantes de línea germinal (SNVs e INDELs) se identificarán con HaplotypeCaller y se filtrarán utilizando filtros estrictos. Las variantes seleccionadas se anotarán con Funcotator, y la patogenicidad de las variantes se evaluará con Varank (v1.4.3). La frecuencia y distribución de los SNVs e INDELs detectados se compararán con bases de datos de donantes sanos (NHLBI-ESP y gnomAD) utilizando ANNOVAR.

      Integración Multi-Ómica Los datos ómicos se integrarán utilizando pipelines desarrollados por la Unidad de Bioinformática del IBSAL. Se aplicarán herramientas de aprendizaje automático (Random Forest, SVM) y análisis de redes (Análisis de Red de Co-expresión Génica Ponderada, WGCNA) para identificar patrones moleculares comunes y específicos del tipo de tumor. Análisis de Factores Multi-Ómicos (MOFA). La integración de datos multi-ómicos y clínicos permitirá el desarrollo de modelos predictivos de respuesta al ejercicio físico.

      Evaluaciones Clínicas, Funcionales y Psicológicas Todos los resultados clínicos y funcionales se recopilarán en tres momentos: 1) antes de comenzar el programa, 2) después de 12 semanas de intervención, 3) seguimiento a 6 meses.

      En todos los casos, se evaluará a todos los individuos: Fuerza muscular (Dinamometría), composición corporal (Tanita BC-418), estado funcional (Batería de Rendimiento Físico Corto), calidad de vida (EORTC QLQ-C30), Bienestar psicológico (Escala de ansiedad y depresión hospitalaria), calidad del sueño (Escala de Insomnio de Atenas), nivel de actividad física (Cuestionario Internacional de Actividad Física).

      Intervención La intervención de ambos grupos (programa de entrenamiento de fuerza y un programa de ejercicio domiciliario) se detalla en los protocolos de estudio publicados.