정밀 신체 운동을 통한 맞춤형 혈액종양학. (PEPOH)

PEPOH 프로젝트의 주요 목표는 다중 오믹스 데이터셋의 철저하고 체계적인 통합을 통해 (활성 치료 중 및/또는 치료 과정 중) 환자의 고형 및/또는 혈액종양에 대한 근력 운동의 임상적 반응을 특성화하고 예측하여, 치료 내성, 질병 진행 및 전체 생존과 연관된 시그니처를 결정하는 것입니다.

이 주요 목표로부터 여러 구체적인 목표가 파생됩니다:

1. - 차세대 시퀀싱(RNA, SNPs, CHIP), 프로테오믹스 및 메타볼로믹스를 통해 말초혈액에서의 차등적 분자 프로파일을 해독하여 운동이 환자에게 미치는 영향을 포괄적으로 분석하기 위한 새로운 통찰력을 제공함으로써 신체 활동의 면역조절 효과를 결정합니다.

2. - 혈액종양 환자에 대한 신체 운동 프로그램이 전체 삶의 질과 관련된 그들의 내재적 능력의 다차원적 지표에 미치는 영향을 평가합니다:

   1. - 기능적 신체 상태 (근력, 보행 속도, 균형 및 피로).
   2. - 심리적 웰빙 및 정신 건강.
   3. - 체성분 및 인체 측정 변수.

   4. - 수면의 질, 전체 삶의 질, 그리고 암 관련 삶의 질.

      이 모든 목표는 현대 종양학의 세 가지 주요 우선순위에 부응합니다:

      1. 운동의 치료적 효과를 뒷받침하는 생리학적 및 분자 메커니즘을 이해하는 것.
      2. 혈액종양 환자와 같이 매우 취약하고 대표성이 부족한 인구 집단에서 강력한 증거를 생성하는 것.
      3. 암의 임상적 관리 내에서 표준화된 보조적 중재로서 근력 운동을 통합하기 위한 기반을 마련하는 것.

      PEPOH의 부가 가치는 기초 과학과 임상 실무, 분자 생물학과 운동 생리학, 다중 오믹스 분석과 포괄적인 환자 평가를 결합한 번역적이고 다학제적인 접근 방식에 있습니다. 이러한 틀을 통해, 이 프로젝트는 암 환자의 생존, 웰빙 및 삶의 질을 향상시킬 수 있는 맞춤형 치료 도구로서 신체 운동을 통합함으로써 종양학 치료의 패러다임 전환에 기여하는 것을 목표로 합니다.

      PEPOH 프로젝트의 다학제적 측면을 염두에 두고, 근력 운동 중인 혈액종양 환자의 다중 오믹스 특성화를 통해 얻어진 분자 지문은 치료 내성 및 생존과 관련되어 있으므로, 그 치료적 사용의 생물학적 기초를 제공하기 위한 자산이 될 것입니다. 또한, 이러한 분자 시그니처는 염증 조절, 에너지 대사, 종양 면역, 근육 가소성, 노화 및 허약함에 대한 새로운 생물학적 통찰력을 제공할 수 있습니다. 이 모든 발견은 연구자들이 운동 후 관찰되는 기능적 및 정서적 개선을 설명하는 메커니즘을 해독할 수 있게 해줄 것입니다.

      더 나아가, 잘 특성화되고 정의된 환자 코호트에 대한 심층적인 다중 오믹스 특성화는 새로운 데이터셋을 제공할 것이며, 이는 향후 생의학 연구에 매우 유용할 수 있고 과학계를 위한 참고 자료가 될 수 있습니다.

      임상적 관점에서, 분자 및 임상 데이터셋의 체계적이고 정확한 통합은 각 환자와 종양에 대한 운동 중재의 효능을 평가하는 데 도움이 되는 예측적 반응 모델의 개발을 가능하게 할 것이며, 이를 정밀 운동이라고 합니다.

      요약하면, PEPOH 프로젝트는 암 환자에 대한 포괄적 접근 내에서 맞춤형이고 비용 효율적인 보조적 중재로서 운동을 통합하기 위한 번역적 증거를 제공하여, 정밀 종양학의 발전에 기여할 것입니다.

      연구 설계 PEPOH는 무작위 배정, 대조군 임상 시험입니다. 이 연구는 FIBSAL의 기술적 및 과학적 지원과 함께 살라망카 대학 병원에서 수행될 것입니다.

      연구 대상

      이 시험은 다음과 같은 진단에 해당하는 5개의 환자 코호트를 포함할 것입니다: 폐암, 대장암, 유방암, 만성 림프구성 백혈병, 다발성 골수종. 각 코호트는 50명의 환자로 구성되며, 총 250명의 환자 샘플이 됩니다. 기초 평가 후, 환자는 무작위로(1:1) 두 연구 그룹 중 하나에 배정될 것입니다:

      감독 중재 그룹: 전문가 감독 하에 주당 2회, 12주 동안 수행되는 근력 운동 프로그램으로, 가정 기반 운동 프로그램이 보완됩니다.

      대조군 그룹: 감독 그룹과 동일한 권장사항 및 지침을 따르지만 감독 대면 세션이 없는 가정 기반 운동 프로그램.

      평가는 기초 시점과 12주 중재 후에 수행되며, 중기적으로 임상적 및 분자적 효과의 지속성을 분석하기 위해 6개월 후에 추가 추적 조사가 수행됩니다.

      포함 기준:

      • 성인 환자(≥18세), 동의서에 서명할 수 있고 연구에 참여할 의사가 있는 자.
      • 수행 상태(ECOG) 0-2.

      연구에 참여하는 각 코호트에 대한 구체적인 포함 기준은 다음과 같이 정의됩니다:

      폐암: 전이성 비소세포 폐암 진단을 받고, 활성 치료 중이며, 면역요법과 화학요법 병합 치료가 가능한 환자.

      대장암: 2기, 3기 또는 4기 대장암 절제술을 받고 보조 화학요법을 받고 있는 환자.

      유방암: 조직학적으로 확인된 호르몬 수용체 양성/HER2 음성 유방암 진단을 받고, 보조적 또는 안정적 전이 단계에서 활성 호르몬 요법(타목시펜, 방향화효소 억제제, 풀베스트란트)을 받고 있는 여성 환자.

      만성 림프구성 백혈병(CLL): 약물 치료를 받지 않았고 필요하지 않은 CLL 진단을 받은 환자.

      다발성 골수종(MM): 활성 1차 치료를 받고 있고 자가 조혈모세포 이식 대상이 아닌 새로운 MM 진단이 확인된 환자.

      제외 기준:

      불안정한 골전이 또는 골절 위험이 높은 광범위한 골 침범의 존재.

      연구자의 판단에 따라 신체 운동을 금기시킬 수 있는 통제되지 않은 심혈관, 호흡기, 근골격계 또는 대사 질환.

      운동 훈련에 대한 명시적 의학적 금기사항. 문서화된 낮은 순응도(<80%). 치료 중단, 질병 진행, 불내성 또는 연구자의 의견에 따라 참가자 안전이나 연구의 무결성을 훼손할 수 있는 기타 의학적, 개인적 또는 물류적 상황.

      표본 크기 연구의 표본 크기를 평가하기 위해 개인 간 요인(대조군 및 중재 그룹)과 개인 내 요인(사전-사후 및 6개월 추적 조사)을 가진 이원 분산분석 설계가 선택되었습니다. 효과 크기 f=0.20, 유의 수준 5%, 검정력 80%, 반복 측정 간 상관관계 0.5를 고려할 때 필요한 총 표본 크기는 42명입니다. 두 실험 그룹 간에 20%의 추적 조사 손실이 있을 수 있는 것으로 추정되므로, 각 코호트당 총 표본 크기는 50명입니다.

      방법론 연구의 생물학적 샘플 말초혈액 샘플(EDTA 튜브 10mL 1개)은 세 시점에서 수집될 것입니다: 1) 프로그램 시작 전; 2) 12주 중재 후; 3) 6개월 추적 조사 시. 분리된 말초혈액 단핵구(PBMC), 혈청 및 혈장은 IBSAL 생물은행에 표준화된 조건 하에 적절히 보존될 것입니다.

      프로테오믹스 특성화 PreOmics® ENRICHplus 기술을 통한 혈장의 정량적 프로테오믹스 분석으로, 이온 이동도 분광법(LC-IMS/MS)과 결합된 액체 크로마토그래피가 뒤따르며, 최소 혈장 부피(50μL)에서 재현 가능하고 고감도 분석을 가능하게 합니다.

      용출된 펩타이드의 정량적 프로테오믹스 분석은 60개 샘플/일의 분리 방법을 사용하여, MS timsTOF Pro 2(Bruker Corporation, USA)에 결합된 LC Evosep One 시스템(Evosep Biosystems, Denmark)에서 수행될 것입니다. 질량/전하 범위 100~1700 및 이온 이동도 범위 0.85-1.30 1/K0, 사이클 시간 100ms로 DIA-PASEF 접근법이 적용될 것입니다.

      면역표현형 분석 면역 세포군 분석(목표 1)을 위해, 연구자들은 CD45, CD3, CD4, CD8, CD5, CD7, TCR, CD27, CD45RA, CD127, CD25RA, CD56, HLA-DR, CD11c, CD123, CD33, CD14 및 CD16에 대한 항체를 포함하는 패널을 사용하며, 최소 500,000 이벤트를 획득합니다. 이 패널은 T 림프구, NK 세포, 수지상 세포 및 단핵구의 다양한 하위 집단 식별을 가능하게 합니다. B 세포 분석을 위해 EuroFlow에서 설명한 LST 스크리닝 전략을 사용할 것입니다. 모든 분석은 8색 FACScanto 세포 분석기 및 Infinicyt 소프트웨어를 사용하여 수행됩니다. 모든 샘플은 살라망카 대학교 일반 유세포 분석 서비스(www.nucleus.usal.es) 및 혈액학과에서 처리될 것입니다.

      메타볼로믹스 프로파일링 혈장 단백질은 메탄올로 침전되고, 인지질은 SPE로 추출될 것입니다. 여과 후, 각 용액은 D₂O로 600 μL로 조정되고 5 mm NMR 튜브로 옮겨질 것입니다. NMR 분석은 cryoprobe가 장착된 Bruker Avance Neo 400 MHz 분광계에서 298 K에서 수행될 것입니다. 매개변수는 Chenomx NMR Suite 10(Chenomx, Edmonton, Canada)를 사용하여 대사체 정량화에 최적화될 것입니다. 대사체 식별 및 정량화는 복잡한 스펙트럼에서 신뢰할 수 있는 디콘볼루션 및 농도 결정을 가능하게 하는 이 소프트웨어로 수행될 것입니다. 양성자 피크 할당은 화학적 이동을 Human Metabolome Database(http://www.hmdb.ca)와 비교하여 추가로 검증될 것입니다.

      전사체 및 유전체 분석 cfRNA 및 DNA 추출 혈장 cfRNA 추출은 저수율 및 짧은 RNA 조각에 최적화된 miRNeasy Serum/Plasma Advanced Kit(Qiagen)를 사용하여 수행됩니다. RNA 농도 및 순도는 Qubit RNA HS Assay(Invitrogen)를 사용하여 형광 측정법으로 결정됩니다. 혈장 ctDNA는 QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit(Qiagen, Hilden, Germany)를 사용하여 추출됩니다. 유전체 DNA(gDNA)는 표준 프로토콜에 따라 QIAamp DNA Blood Midi Kit(Qiagen, Germany)를 사용하여 말초혈액에서 분리될 것입니다.

      라이브러리 준비 및 시퀀싱 cfRNA 라이브러리는 저 RNA 입력 및 짧은 조각에 최적화된 Qiagen QIAseq cfRNA All-in-One Kit를 사용하여 생성됩니다. 시퀀싱은 NovaSeq X 시퀀서(Illumina, San Diego, CA, USA)에서 수행되어, 저발현 전사체의 검출을 극대화하기 위해 평균 깊이 5천만 개 이상의 리드를 생산하는 150bp 쌍말단 리드(2×150bp)를 생성할 것입니다.

      ctDNA 및 gDNA 라이브러리 준비 및 시퀀싱은 SureSelect V6 캡처 키트(Agilent, Santa Clara, CA, USA) 및 Illumina 기술(NovaSeq 6000, 150PE 2×150bp)을 사용하여 수행되며, 샘플당 평균 시퀀싱 깊이 18Gb에 도달할 것입니다.

      생물정보학 분석 시퀀싱에서 얻은 FASTQ 파일의 품질은 FastQC(고처리량 시퀀스 데이터 품질 관리 도구)로 평가될 것입니다. 원시 리드는 FastQC 및 MultiQC로 품질 관리를 거친 후, Trimmomatic를 사용하여 어댑터 트리밍 및 저품질 리드 제거가 수행됩니다. 인간 참조 유전체(GRCh38)에 대한 정렬은 STAR(v2.7)로 수행되고, 유전자 풍부도는 featureCounts(Subread 패키지)를 사용하여 정량화됩니다. 정규화 및 차등 발현 분석은 DESeq2(Bioconductor)를 사용하여 수행되며, 조정된 p-값 <0.05를 유의성 임계값으로 적용합니다. 기능 및 경로 농축 분석은 clusterProfiler, GOplot 및 GSEA로 수행됩니다. 차등 발현 유전자는 역전사 및 정량적 실시간 PCR로 검증될 것입니다.

      유전체 분석 쌍말단 리드는 BWA-MEM(v0.7.17)을 사용하여 인간 유전체(GRCh37)에 정렬됩니다. 결과 SAM 파일은 MarkDuplicatesSpark(GATK)를 사용한 중복 제거를 포함한 하류 분석의 효율성을 개선하기 위해 처리됩니다. 염기 품질 점수 재보정은 BaseRecalibrator 및 ApplyBQSR(GATK)로 수행됩니다. 체성 변이 탐지는 Mutect2(GATK, 쌍 모드)로 수행된 후 FilterMutectCalls를 사용하여 필터링됩니다. 생식선 변이(SNV 및 INDEL)는 HaplotypeCaller로 식별되고 하드 필터를 사용하여 필터링됩니다. 선택된 변이는 Funcotator로 주석 처리되고, 변이 병원성은 Varank(v1.4.3)로 평가됩니다. 검출된 SNV 및 INDEL의 빈도 및 분포는 ANNOVAR를 사용하여 건강한 기증자 데이터베이스(NHLBI-ESP 및 gnomAD)와 비교됩니다.

      다중 오믹스 통합 오믹스 데이터는 IBSAL 생물정보학 유닛에서 개발한 파이프라인을 사용하여 통합됩니다. 기계 학습 도구(랜덤 포레스트, SVM) 및 네트워크 분석(가중 유전자 공발현 네트워크 분석, WGCNA)이 공통 및 종양 유형 특이적 분자 패턴 식별에 적용됩니다. 다중 오믹스 요인 분석(MOFA). 다중 오믹스 및 임상 데이터의 통합은 신체 운동에 대한 반응의 예측 모델 개발을 가능하게 할 것입니다.

      임상적, 기능적 및 심리적 평가 모든 임상적 및 기능적 결과는 세 시점에서 수집됩니다: 1) 프로그램 시작 전, 2) 12주 중재 후, 3) 6개월 추적 조사 시.

      모든 경우에 모든 개인이 평가될 것입니다: 근력(동적측정법), 체성분(Tanita BC-418), 기능적 상태(단신체 수행력 배터리), 삶의 질(EORTC QLQ-C30), 심리적 웰빙(병원 불안 및 우울 척도), 수면의 질(아테네 불면증 척도), 신체 활동 수준(국제 신체 활동 설문지).

      중재 두 그룹(근력 운동 프로그램 및 가정 기반 운동 프로그램)의 중재는 게시된 연구 프로토콜에 상세히 설명되어 있습니다.