歯周炎患者における非外科的治療の効果：歯肉溝滲出液中の炎症性メディエーターに焦点を当てて (NONSURG)

歯周炎は、歯周ポケット内の歯面に定着するディスバイオティックな微生物叢によって引き起こされ、歯周組織に慢性炎症を誘発し、その後、歯を支える組織の破壊と喪失につながります。 重度の歯周炎は世界人口のかなりの割合に影響を及ぼし、歯の喪失につながる可能性があります。 歯周組織における宿主の免疫応答は、骨喪失につながる一連のイベントの原因となっています。 歯周炎に罹患した歯肉組織では、浸潤免疫細胞と常在歯肉細胞がサイトカインとマトリックス分解酵素を産生し、歯周病原体を排除します。 歯肉溝滲出液（GCF）は部位特異的な滲出液であり、炎症を起こした歯肉では、そこで起こる炎症過程を反映し、GCF中のIL-6、IFN-γ、IL-βなどの炎症性サイトカインが歯周炎の重症度と相関することが示されています。 さらに、GCFは非侵襲的で容易に収集できる分析用の液体です。 ケモカインはサイトカインの特殊なサブグループであり、主に走化性を介して炎症部位への免疫細胞の移動を指示します。 好中球のホーミングは高度に選択的な過程であり、CXCL1、CXCL2、CXCL8などの特定の好中球走化因子の発現が歯周炎の病因において重要な役割を果たします。 さらに、マクロファージは歯周病において、炎症促進性から抗炎症性までの活性化のスペクトルを持つと報告されています。 マクロファージ遊走阻止因子（MIF）はマクロファージの恒常性維持に重要な役割を果たします。 MIFは多様な機能を持ち、炎症過程、骨代謝、血管新生、アポトーシスに対して保護的および有害な効果の両方を持つと報告されています。 血管内皮増殖因子-C（VEGF-C）は血管内皮増殖因子ファミリーの重要な一員であり、血管およびリンパ管の成長を促進します。 さらに、病理学的状態におけるリンパ管の成長（リンパ管新生）とリモデリングは、罹患組織内およびその周囲のリンパ管内皮細胞（LEC）によって発現されるケモカインとその受容体の影響を受けます。 リンパ管新生はマウスにおける歯周炎症と関連しています。 ヒトでは、樹状細胞の遊走に重要なリガンドであるCCL21が、歯周炎患者のリンパ管でダウンレギュレーションされています。 VEGF-Cレベルは癌の予後不良と関連しており、MIFとVEGF-Cの発現が強く相関すると報告する研究があります。 私たちの知る限り、ヒトGCFにおけるVEGF-C発現はこれまで調査されたことがありません。 非外科的歯周治療（NSPT）を受ける患者では、治療の目的は炎症をコントロールし、正常な微生物叢を再確立することで歯周組織の治癒を促進することです。 喫煙者では、NSPT後の治癒応答が阻害されると以前に報告されました。 喫煙は微生物組成を調節し、主要な歯周病原体の定着を促進するようです。 新たな証拠は、GCF中の特定のサイトカインとケモカインが、歯周炎の病因、予後、およびNSPTへの反応を決定するための有望なバイオマーカーとして機能することを示唆しています。 この研究では、研究者は重度歯周炎を有する喫煙者と非喫煙者の深いポケットからNSPT前およびNSPT中に収集したGCF中のケモカイン/サイトカインおよびVEGF-Cの発現を分析しました。 ベースラインでは、研究者はまた、喫煙者と非喫煙者の浅い歯周ポケットと深い歯周ポケット間でこれらのマーカーのレベルを比較しました。

材料と方法 研究集団：西ノルウェー口腔保健専門センターの専門クリニックに歯周治療のために紹介された個人が、本研究への参加を招待されました。 組み入れ基準は、EFP/AAP分類システムに従ってステージIIIおよびIVの歯周炎と診断された被験者でした。 すべての適格参加者（n=30、年齢＞16歳）には喫煙歴について尋ねられ、過去5年間に喫煙者であった場合は喫煙者と識別されました。 被験者は、過去6か月以内の抗生物質の使用、妊娠、授乳、慢性高用量ステロイド療法、放射線療法、または免疫抑制療法を報告した場合に除外されました。 彼らは、よく制御された糖尿病を報告した場合には除外されませんでした。 本研究は西ノルウェー地域医学研究倫理委員会（REK）によって承認されました、2017/1650/REK Nord。 研究への組み入れ前にすべての患者からインフォームドコンセントが得られました。分析に含まれる部位の臨床検査プロービングポケット深さ（PPD）、臨床的付着喪失（CAL）、およびプロービング時の出血（BOP）が、第三大臼歯を除く歯ごとに4部位から測定され、診断は最初のスクリーニング訪問時に1人の歯周病専門医によって実施されました。 喫煙習慣と糖尿病に関する情報が収集されました。 歯肉溝滲出液（GCF）のサンプリングはスクリーニング後に決定され、各患者について浅いポケット（≤4mm）1つと深いポケット（≥5 mm）1つで構成されました。 深いポケットを持つ歯のみが、歯周病専門医によって治療の3つの時点後も持続すると推定され、ベースラインでのNSPT前にサンプリングのために選択されました。 GCFはT0で浅いポケットと深いポケットから、およびT1とT2でNSPT前に深いポケットから収集されました。

同じ歯周病専門医がすべての患者をNSPTで検査および治療し、GCFサンプルを収集しました。 GCFは各時点で、キュレットによる歯肉縁上プラーク除去後に収集され、唾液による汚染を防ぐために歯は綿球で隔離されました。 GCFサンプルはフィルターペーパーストリップ（PerioPaper, OraFlow Inc., Hewlett, New York, USA）を使用して収集され、軽い抵抗があるまで歯肉縁下に30秒間挿入されました。 ストリップは直ちにエッペンドルフチューブに移され、さらなる分析まで-80°Cで保存されました。 ストリップ入りのチューブは、サンプリング前後にMettler Toledo AT261（DeltaRange®, Switzerland 読み取り精度: 0.01mg）を使用して重量を測定し、体積が質量に等しいという式（1μlは1mgに等しい）を使用してGCF体積を取得しました。 深いポケットと浅いポケットからのサンプルは別々のエッペンドルフチューブに保管されました。 最終濃度12mM（pH 7.6）のTris-HCL緩衝液（200μl）がタンパク質溶出のために各チューブに添加されました。 各サンプルの総タンパク質濃度は、NanoDrop Lite Plus Micro-UV Spectrophotometer（Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE, USA）を使用して供給者の指示に従って測定されました。 ビーズベースイムノアッセイ 市販のビーズベースイムノアッセイBio-Rad（カタログ番号 # 171AK99MR2, BioRad, Hercules, CA, USA）を使用して、40のケモカイン/サイトカインのレベルがpg/mlで決定されました。 さらに、VEGF-CはMilliplexパネル（カタログ番号 # HAGP1MAG-12K, Merck KGaA, Darmstadt, Germany）を使用して分析されました。 すべての多重イムノアッセイパネルについてメーカーのプロトコルに従いました。 各測定前に、システムの較正と検証が行われ、ビーズ読み取りの精度と信頼性が確保されました。 各分析物の標準曲線は、5パラメータロジスティック回帰曲線を使用してBio-Plex managerソフトウェア（バージョン6.0、BioRad）で分析されました。 外れ値はシステムによって除去されました。

統計分析すべての分析はR v4.5.2（28）で実施されました。 プロットはR（29）のggplot2パッケージを使用して作成されました。 平均、標準誤差（SE）、中央値、およびパーセンテージを含む記述統計が、研究参加者の人口統計学的特性を要約するために使用されました。 ベースライン（T0）での深いポケット対浅いポケットの比較：ポケット深さと喫煙状態の効果を評価するために、R（30）のlme4パッケージのlmer()関数を使用して混合効果モデルを適合させました。固定効果のP値はlmerTestパッケージ（31）で取得されました。 混合効果アプローチは、個人内の対サンプリング（患者ごとに浅い歯周ポケット1つと深い歯周ポケット1つ）によって導入される依存性を説明するために選択され、個人のランダム切片がランダム効果として含まれました。 モデルには、ポケット深さ（浅い対深い）、喫煙状態、およびそれらの交互作用が予測因子として含まれました；交互作用項は明らかに非有意（P≥0.1）の場合に除去されました。 サンプルサイズの制約により、性別と年齢は主要モデルには共変量として含まれませんでしたが、それらの潜在的な影響は別個の分析で検討されました。 縦断分析；反復治療の効果 深いポケットにおけるNSPT後のPPD、CAL、ケモカイン発現、およびGCF体積の変化を評価するために、3つの時点で収集された反復測定値を分析しました：ベースライン（T0）、フォローアップ1（T1）、フォローアップ2（T2）。 各測定値は各患者内の同じ部位から得られ、個人ごとに3つの観測値を生み出しました。 したがって、私たちは上記と同じタイプの混合効果モデルを適用し、ポケット深さを順序カテゴリカル予測因子（レベル：T0、T1、T2）としての反復NSPTに置き換えました。 NSPT効果の代替として、各炎症マーカーについてT0からT2への改善を示した個人の割合を計算しました。 個人は、NSPT後に減少を示した場合に成功と分類されました。 各マーカーについて、二項検定を使用して成功の割合を検定し、帰無仮説をp=0.5（すなわち、成功と失敗のランダムな分布）と仮定しました。 分析は、喫煙者と非喫煙者、および結合サンプルについて別々に実施されました。VEGF-C測定値の分布特性 - 具体的には、ゼロ値の高い割合 - を考慮して、データは2つのカテゴリに二分されました：検出なし（0）と検出あり（1）。 この二値アウトカムは、Rのlme4パッケージのglmr()関数を介して実装された二項誤差分布を持つ一般化線形混合効果モデル（GLMM）を使用して分析されました。 VEGF-Cについては、喫煙状態、性別、または年齢の影響は評価されませんでした。