Wpływ niechirurgicznego leczenia pacjentów z zapaleniem przyzębia ze szczególnym uwzględnieniem mediatorów zapalnych w płynie dziąsłowym (NONSURG)

Zapalenie przyzębia jest inicjowane przez dysbiotyczną mikrobiotę, która kolonizuje powierzchnię zęba w kieszonce przyzębnej, indukując przewlekły stan zapalny w tkankach przyzębia, co następnie prowadzi do zniszczenia i utraty tkanek podporowych zęba. Ciężkie zapalenie przyzębia dotyka znacznej części światowej populacji i może prowadzić do utraty zębów. Odpowiedzi immunologiczne gospodarza w tkankach przyzębia są odpowiedzialne za kaskadę zdarzeń prowadzących do utraty kości. W tkance dziąsła dotkniętej zapaleniem przyzębia, naciekające komórki odpornościowe i rezydujące komórki dziąsła produkują cytokiny i enzymy degradujące macierz, aby eliminować periodontopatogeny. Płyn dziąsłowy (GCF) jest wysiękiem specyficznym dla miejsca, który w stanie zapalnym dziąseł odzwierciedla proces zapalny tam zachodzący, a cytokiny zapalne, takie jak IL-6, IFN-γ, IL-β w GCF, wykazano, że korelują z ciężkością zapalenia przyzębia. Dodatkowo, GCF jest płynem nieinwazyjnym i łatwym do pobrania do analizy. Chemokiny są wyspecjalizowaną podgrupą cytokin, które głównie kierują ruchem komórek odpornościowych do miejsc zapalenia poprzez chemotaksję. Napływ neutrofilów jest wysoce selektywnym procesem, w którym ekspresja specyficznych chemoatraktantów neutrofilów, takich jak CXCL1, CXCL2 i CXCL8, odgrywa znaczącą rolę w patogenezie zapalenia przyzębia. Co więcej, makrofagi są zgłaszane jako mające spektrum aktywacji, od prozapalnej do przeciwzapalnej, w chorobie przyzębia. Czynnik hamujący migrację makrofagów (MIF) odgrywa kluczową rolę w utrzymaniu homeostazy makrofagów. Zgłasza się, że ma różnorodne funkcje, z zarówno ochronnymi, jak i szkodliwymi efektami w procesie zapalnym, metabolizmie kości, angiogenezie i apoptozie. Czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowego-C (VEGF-C) jest ważnym członkiem rodziny czynników wzrostu śródbłonka naczyniowego, przyspieszającym wzrost naczyń krwionośnych i limfatycznych. Ponadto, wzrost (limfangiogeneza) i remodelowanie naczyń limfatycznych w warunkach patologicznych są pod wpływem chemokin i ich receptorów eksprymowanych przez komórki śródbłonka limfatycznego (LEC) wewnątrz i wokół dotkniętej tkanki. Limfangiogeneza została powiązana ze stanem zapalnym przyzębia u myszy. U ludzi, CCL21, ligand ważny dla migracji komórek dendrytycznych, jest obniżony w naczyniach limfatycznych u pacjentów z zapaleniem przyzębia. Poziom VEGF-C jest powiązany ze złym rokowaniem w raku, a badania zgłosiły, że ekspresja MIF i VEGF-C są silnie skorelowane. Według naszej najlepszej wiedzy, ekspresja VEGF-C w ludzkim GCF nigdy nie była badana. U pacjentów poddawanych niechirurgicznej terapii periodontologicznej (NSPT), celem leczenia jest kontrola stanu zapalnego i promowanie gojenia tkanki przyzębia poprzez przywrócenie normalnej mikrobioty. U palaczy, utrudniona odpowiedź gojenia po NSPT była wcześniej zgłaszana. Palenie wydaje się modulować skład mikrobiomu i promować kolonizację kluczowych patogenów przyzębia. Nowe dowody sugerują, że pewne cytokiny i chemokiny w GCF służą jako obiecujące biomarkery do określania patogenezy, rokowania zapalenia przyzębia i odpowiedzi na NSPT. W tym badaniu, badacze analizowali ekspresję chemokin/cytokin i VEGF-C w GCF od palaczy i niepalących z ciężkim zapaleniem przyzębia w głębokich kieszonkach przed i podczas NSPT. Na początku badania, badacze porównali również poziomy tych markerów między płytkimi i głębokimi kieszonkami przyzębnymi u palaczy i niepalących.

Materiały i metody Populacja badania: Osoby skierowane do kliniki specjalistycznej w Centrum Ekspertyzy Zdrowia Jamy Ustnej, Zachodnia Norwegia na leczenie periodontologiczne, zostały zaproszone do udziału w obecnym badaniu. Kryteria włączenia obejmowały osoby zdiagnozowane z zapaleniem przyzębia w stadium III i IV według systemu klasyfikacji EFP/AAP. Wszyscy kwalifikujący się uczestnicy (n=30, wiek >16 lat) zostali zapytani o historię palenia i zidentyfikowani jako palacze, jeśli palili przez ostatnie 5 lat. Osoby zostały wykluczone, jeśli zgłaszały użycie antybiotyków w ciągu ostatnich 6 miesięcy, ciążę, laktację, przewlekłą terapię steroidową w wysokich dawkach, radioterapię lub terapię immunosupresyjną. Nie zostały wykluczone, jeśli zgłaszały dobrze kontrolowaną cukrzycę. Obecne badanie zostało zatwierdzone przez Regionalny Komitet Etyki Badań Medycznych w Zachodniej Norwegii (REK), 2017/1650/REK Nord. Świadome zgody zostały uzyskane od wszystkich pacjentów przed włączeniem do badania. Badanie kliniczne miejsc włączonych do analizy Głębokość sondowania kieszonki (PPD), utrata przyczepu klinicznego (CAL) i krwawienie przy sondowaniu (BOP) były mierzone z czterech miejsc na ząb z wyjątkiem trzecich zębów trzonowych, a diagnoza została przeprowadzona przez jednego periodontologa podczas pierwszej wizyty przesiewowej. Zebrano informacje dotyczące nawyków palenia i cukrzycy. Pobieranie płynu dziąsłowego (GCF) zostało ustalone po przesiewie i obejmowało jedną płytką (≤4mm) i jedną głęboką kieszonkę (≥5 mm) dla każdego pacjenta. Tylko zęby z głębokimi kieszonkami, oszacowane przez periodontologa jako utrzymujące się po trzech punktach czasowych leczenia, zostały wybrane do pobierania przed NSPT na początku (T0). GCF był pobierany z płytkich i głębokich kieszonek w T0, oraz z głębokich kieszonek w T1 i T2 przed NSPT.

Ten sam periodontolog badał i leczył wszystkich pacjentów NSPT oraz pobierał próbki GCF. GCF był pobierany w każdym punkcie czasowym po usunięciu płytki naddziąsłowej kiretą, a zęby były izolowane wałkami z waty, aby zapobiec zanieczyszczeniu śliną. Próbki GCF były zbierane przy użyciu pasków bibułkowych (PerioPaper, OraFlow Inc., Hewlett, Nowy Jork, USA) włożonych poddziąsłowo aż do lekkiego oporu, przez 30s. Paski były natychmiast przenoszone do probówek Eppendorf i przechowywane w -80 °C do dalszej analizy. Probówki z paskami były ważone przy użyciu Mettler Toledo AT261 (DeltaRange®, Szwajcaria czytelność: 0.01mg) przed i po pobraniu, aby uzyskać objętość GCF, używając wzoru objętość równa masie (jeden µl równy jednemu mg). Próbki z głębokich i płytkich kieszonek były przechowywane w oddzielnych probówkach Eppendorf. Bufor Tris-HCL (200 µl) z końcowym stężeniem 12mM (pH 7.6) został dodany do każdej probówki do elucji białek. Całkowite stężenie białka dla każdej próbki było mierzone przy użyciu NanoDrop Lite Plus Micro-UV Spektrofotometru (Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE, USA) zgodnie z instrukcją dostawcy. Test immunologiczny oparty na kulkach Przy użyciu komercyjnie dostępnego testu immunologicznego opartego na kulkach Bio-Rad (numer katalogowy # 171AK99MR2, BioRad, Hercules, CA, USA), poziomy 40 chemokin/cytokin były określane w pg/ml. Dodatkowo, VEGF-C był analizowany przy użyciu panelu Milliplex (numer katalogowy # HAGP1MAG-12K, Merck KGaA, Darmstadt, Niemcy). Protokoły producenta były przestrzegane dla wszystkich paneli testów immunologicznych multiplex. Przed każdym pomiarem, kalibracja i walidacja systemu były przeprowadzane, aby zapewnić dokładność i wiarygodność odczytów kulek. Krzywa standardowa dla każdego analitu była analizowana przy użyciu pięcioparametrowej regresji logistycznej przy użyciu oprogramowania Bio-Plex manager (wersja 6.0, BioRad). Wartości odstające były usuwane przez system.

Analiza statystyczna Wszystkie analizy były przeprowadzone w R v4.5.2 (28). Wykresy były tworzone przy użyciu pakietu ggplot2 w R (29). Statystyki opisowe, w tym średnia, błąd standardowy (SE), mediana i procenty, były używane do podsumowania charakterystyk demograficznych uczestników badania. Porównania na początku (T0) głębokich vs płytkich kieszonek: Aby ocenić efekty głębokości kieszonki i statusu palenia, dopasowaliśmy modele efektów mieszanych przy użyciu funkcji lmer() z pakietu lme4 w R (30). Wartości P dla efektów stałych były uzyskiwane z pakietu lmerTest (31). Podejście efektów mieszanych zostało wybrane, aby uwzględnić zależność wprowadzoną przez sparowane pobieranie próbek w obrębie osób (jedna płytka i jedna głęboka kieszonka przyzębna na pacjenta), z indywidualnymi losowymi punktami przecięcia włączonymi jako efekt losowy. Model obejmował głębokość kieszonki (płytka vs głęboka), status palenia i ich interakcję jako predyktory; termin interakcji był usuwany, gdy wyraźnie nieistotny (P≥0.1). Ze względu na ograniczenia wielkości próby, płeć i wiek nie były włączane jako kowariancje w głównych modelach, chociaż ich potencjalny wpływ był badany w oddzielnych analizach. Analiza podłużna; efekty powtarzanego leczenia Aby ocenić zmiany w PPD, CAL, ekspresji chemokin i objętości GCF po NSPT w głębokich kieszonkach, analizowaliśmy powtarzane pomiary zebrane w trzech punktach czasowych: początkowy (T0), kontrola 1 (T1) i kontrola 2 (T2). Każdy pomiar był uzyskiwany z tego samego miejsca w obrębie każdego pacjenta, dając trzy obserwacje na osobę. W związku z tym, zastosowaliśmy ten sam typ modeli efektów mieszanych opisanych powyżej, zastępując głębokość kieszonki powtarzanym NSPT jako uporządkowanym predyktorem kategorialnym (poziomy: T0, T1, T2). Jako alternatywę dla efektów NSPT, obliczyliśmy proporcję osób, które wykazały poprawę od T0 do T2 dla każdego markera zapalnego. Osoby były klasyfikowane jako udane, jeśli wykazywały redukcję po NSPT. Dla każdego markera, testowaliśmy proporcję sukcesów przy użyciu testu dwumianowego, przy założeniu hipotezy zerowej p=0.5 (tj. losowy rozkład sukcesów i porażek). Analizy były przeprowadzane oddzielnie dla palaczy i niepalących, jak również dla połączonej próbki. Biorąc pod uwagę charakterystykę dystrybucji pomiarów VEGF-C - konkretnie, wysoką proporcję wartości zerowych - dane zostały zdychotomizowane na dwie kategorie: brak wykrycia (0) i wykrycie (1). Ten binarny wynik był analizowany przy użyciu uogólnionego liniowego modelu efektów mieszanych (GLMM) z rozkładem błędów dwumianowym, zaimplementowanym poprzez funkcję glmr() w pakiecie lme4 dla R. Efekt statusu palenia, płci lub wieku nie był oceniany dla VEGF-C.